免疫荧光二抗用什么稀释？

请叫我晓白

我用的二抗是TRITC羊抗小鼠IgG，说明书上说用0.01M PBS加入试剂级BSA至1%作为稀释液，意思是指：将BSA稀释到1%浓度，作为二抗的稀释液吗？) u5 U3 L4 m3 w) }2 X
我之前只用的PBS稀释二抗，效果不好，不知道是不是与这个有关

yuhaoze

我觉得没关系

bibottll

是用1%BSA稀释的，至于你染色效果不好，可能与染色许多步骤都有关系，比如透膜封闭的时间等。。。

xiaoyurly

回复 请叫我晓白 的帖子# x6 O" R/ P# O
/ ~! c: e3 A7 P; T
我们图省事一直用PBS稀释，效果也都不错。$ b2 P' ~/ O9 y# |
不知你说的效果不好指的是哪方面，背景高还是特异性差？
+ `" K+ i& }) b$ h免疫染色效果不好不能一味怪在二抗身上，很多因素，比如封闭、是否需要抗原修复、抗体浓度、作用时间等等

请叫我晓白

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3 j6 `6 j8 J7 Y+ v% i) V$ |$ u
. T; T& N  ?$ l+ z* R3 Z(l)连续冰冻切片标本，丙酮固定10min，用PBS3min 3次。2 M7 }4 }; l& G# |- N2 D4 J
(2)3%过氧化氢孵育10分钟，PBs冲洗三次。
, G% R- k2 g# g  M(3)正常羊血清封闭液室温孵育20分钟，倾去，勿洗。: i& }6 M, h5 W
(4)加入50ul一抗（1:100,1:200）。37度 2h* m8 V" W# z$ k% w. f/ e
(5)滴加50ul二抗 室温 30min，DAPI复染5min
3 _5 t3 ~! V; q( {* N7 |(6)封片:封片剂封片
) l8 R; [% K: W0 R; y" u这是我的大概步骤请指导一下哈。非特异性染色比较多

xiaoyurly

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! U6 z9 T5 \9 g9 M% A- x
( t7 ^( `6 Z, G荧光染色不用H2O2处理
* m; s8 F3 ~% y/ @一抗是什么？胞内抗原染色需要Triton破膜处理的
* x$ E3 I9 n% y/ u( r3 e) V抗体作用终浓度在2-5ug/ml即可，酌情稀释抗体7 g5 e* g* X8 d/ o6 v
& q$ L, L; l0 x5 K
私认为一抗4℃过夜效果较好，血清封闭在30-35min

weiyepan

一抗二抗都加点BSA或者脱脂奶，防止非特异性吸附，在ECL中降低背景效果比较明显。荧光抗体强度应该不会比ECL高，加了效果不一定明显，但也可以试试。2 d1 ~  p+ q8 N% a1 \
另外你一抗我看是不是浓度太高了。

芦苇浅

我们做石蜡切片的免疫荧光一般用1%的BSA稀释抗体，1%的BSA指的用0.01M的PBS将BSA稀释至该浓度。

请叫我晓白

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0 v7 i! A# y, r/ w' x3 R多谢这位老师指点。H2O2处理消除内源性过氧化物酶是一篇研究生论文上做心脏组织免疫荧光用的方法，我学习他的方法做的。
% `$ Z# _, {& J一抗是大鼠抗大鼠c-kit，说明书没有建议稀释比例，因此我用了1:100 1:200 两个浓度。一抗产品的浓度是0.5mg/ml 规格100ug。这点还请您指点关于一抗的比例问题。
! Z5 O- [& I# R# E+ |/ W) l" A抗原是位于膜上因此没有破膜
# P8 [0 w. i& V8 G血清封闭37度半小时是否要比室温效果好呢

请叫我晓白

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  }+ K' u/ f$ i; _  j9 n4 i% b0 k1 }4 c1 x8 r: w
我的一抗规格是100ug/200ul（浓度是0.5mg/ml），也就是1ul含0.5ug，按您说的2-5ug/ml，我刚去算了一下1：100稀释正好是5ug/ml，1：250稀释是2ug/ml，也就是说的一抗可以试一下1:100-250之间浓度梯度对吗？