为什么5%脱脂奶封闭需要洗，而BSA、血清不需要洗呢

请叫我晓白

最近做心脏免疫荧光，一抗是生物素标记的，二抗用cy3-亲和素。发现阴性对照没加一抗（一抗也不是染心肌的）心肌全染上色了。因此考虑封闭内源性生物素，准备用鸡蛋清洗后加5%脱脂奶（含吐温20  0.1%）封闭。
6 a; Y+ @% @8 L3 t因此我想提的问题是：; U4 @; A& h$ X/ b0 u
1.用脱脂奶封闭后是否需要PBS洗，为什么血清、BSA不需要洗？9 k# W7 |6 `+ O7 P$ H
2.脱脂奶封闭后或者封闭前是否还需要用血清或BSA封闭？
) `% U2 Y- S) y3.问了很多高手都没用过我的这种生物素标记的单克隆一抗，我染的抗原很稀少，请问我选择的一抗、二抗是否有错误？+ r$ @& O- s2 U( q& P
4.如果我做加做双标染心肌，另一种一抗是兔抗大鼠a-SA，二抗是羊抗兔FITC。那么我还可以继续用5%的脱脂奶封闭，然后洗，不用山羊血清或BSA封闭吗？
1 E6 T$ L! {) T2 D$ I0 a急盼各位高手解惑啊

yuhaoze

1.用什么封闭液要看你的实验设计，脱脂奶粉不适合研究磷酸化，因为奶粉里面含有激酶和磷酸酶，BSA成分单纯，理论上最好，但是实际效果不一定。3 u% g! D& z8 v) G
不管是用什么封闭的，最好都要洗。如果你的一抗稀释液跟你的封闭液一样，也可以不洗，效果不一定好。8 c- H) Q3 I1 N( z+ Q8 c! g# E/ Z
2.用一种封闭液就行了
% y; i& y8 F: v" R! k6 f5 ]3.很多“高手”都没做，说明你做的事情是独特的，建议你去英文文献里面找找，类似你的实验，别人都是怎么做的，照着做就行了。) @: T$ L  w6 ]1 K( y9 _
4.脱脂奶粉和血清成分不确定，如果跟你的抗原或一抗反应，就不能用。9 W1 \' Y/ U  a) G2 X$ {" o- S0 H

weiyepan

哺乳动物细胞生物素化背景很低的。亲和素抗体浓度用太高了吧，那东西分子量是抗体的1/5，结合能力又比一般抗体高，你再往下稀释1~2个数量级做做看？

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-26 11:21 " v$ B' G1 N  r  N2 _2 {7 I( Q
哺乳动物细胞生物素化背景很低的。亲和素抗体浓度用太高了吧，那东西分子量是抗体的1/5，结合能力又比一般抗 ...

0 v3 a3 x$ l3 _6 b7 s8 y/ Q可是我的阴性对照连一抗都没加，全给染上了，而且是背景很好，这种情况是不是肯定发生了结合反应呢？如果没加一抗，那亲和素的浓度影响不大吧？

请叫我晓白

yuhaoze 发表于 2013-4-26 07:58
4 A3 E# z' L2 e0 v1.用什么封闭液要看你的实验设计，脱脂奶粉不适合研究磷酸化，因为奶粉里面含有激酶和磷酸酶，BSA成分单纯， ...

& v- ~  E' H7 _0 Q, F
我的实验不研究磷酸化，只是染心脏一种细胞膜上抗原
: B5 t5 e! R1 j" t! P9 H“不管是用什么封闭的，最好都要洗”啊？为什么所有免疫荧光的步骤都说BSA或血清封闭不洗啊？

weiyepan

6 I* R) A8 a1 p) f2 J% C7 w" a

5 S! J0 b; h% k回复 请叫我晓白 的帖子9 O4 z7 U2 e: |  |1 |7 ?& E

5 @8 O; Y! ^& E6 c! j+ X/ a" C: u我说的是亲和素的非特异性结合，是因为加的浓度太高了，连没有生物素化的蛋白都结合上了。这种情况在WB里面出现特别明显，和一抗没关系。
' l6 S( _5 ~7 s( U) a* t: R) T) L另外建议你的做法是低浓度亲和素低温孵育过夜，如果是压片做的话，二抗里面也加一半浓度的封闭剂，不然的话背景高的很离谱的。
+ c, [; b: R5 Q" X$ f. J, mFYI：封闭剂洗不洗是个人习惯，我是觉得没必要洗，如果封闭剂里面有抗原的话，换一种封闭剂就行了，和洗不洗的干净根本没关系。

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-26 14:34
4 D7 M- V* k5 c9 u7 N+ K" E回复 请叫我晓白 的帖子
' b9 |; ]3 k  D' `! G) @' N, A4 J/ j
我说的是亲和素的非特异性结合，是因为加的浓度太高了，连没有生物素化的蛋白都 ...

& X, D) F$ V2 i/ |5 p4 L5 l多谢。我上次用的5%BSA封闭，抗体稀释液是1%BSA+0.3%triton。我这次准备用蛋清、脱脂奶封闭内源性生物素，然后用BSA封闭，试试结果。多谢你的帮助

weiyepan

回复 请叫我晓白 的帖子! y& T1 a9 M' |

! c) z, ]. Z3 s3 t+ u& a感觉没有办法封闭内源性生物素。生物素是小分子，是特异和亲和素结合的。; j1 q  o" P" q. f, a
而且我感觉你用的二抗是streptavidin而不是avidin，streptavidin是四聚体，不能用于封闭。除非你能找到有单体的没有标记的抗生物蛋白，那你的背景才能封掉。

请叫我晓白

weiyepan 发表于 2013-4-27 10:42 . e; l/ T. T7 t
回复 请叫我晓白 的帖子
  }" s- Q# t6 m% [& P; c7 X' m& c8 {7 n. x" q
感觉没有办法封闭内源性生物素。生物素是小分子，是特异和亲和素结合的。

$ H& w! [# _' K4 O) V
的确是avindin的二抗而不是streptavidin。这个是博士德公司的不会搞错。我看了很多参考文献都说可以用蛋清封闭生物素，这几天造模下周切片再试试