G418筛选细胞，为什mRNA水平和蛋白水平不一致呢？很是郁闷

微笑流滢

而且重组质粒上有His 和Myc标签，用这两种抗体检测时，对照里面也有，郁闷郁闷，问问大家有没有这种情况? 求分享，感激不尽，是我原先筛的克隆不彻底吗？需不需要进行二次筛选？- w) ^2 s2 K, ^- i, e& r/ _

微笑流滢

回复 yangcy-smile 的帖子7 Y0 \6 |/ X# l" q7 a: D3 X
# V9 ?5 H5 j. ~
嗯，老师也建议我这么做，太感谢了

yangcy-smile

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7 M- y4 r6 Y+ a" l; u& Z我师弟在建细胞系的时候遇到过这种情况，他也是筛到最后细胞成了克隆，怎么筛也不死，但是并不都是阳性克隆。我觉得首先确定自己构建的质粒绝对正确，没有空载体的存在。然后转染建稳转时拿什么都不转的细胞来做阴性对照，只是在筛之前对转有质粒和空载体的平行细胞组进行检测，看是否表达，然后确定表达后再对平行转染质粒和没转染的用以前摸索好的G418浓度进行筛选，基本达到阴性全部死亡，阳性克隆存留，这样再对建成的稳转细胞系进行RT或者Western检测时用没转染的细胞做阴性对照即可。一点拙见，可能帮不上忙。

微笑流滢

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: `' F% i6 k2 u: E) Z. d我筛完克隆后剩下的细胞还保留着，我是再复苏起来继续筛呢？还是再重新转染呢？有什么好的建议吗？？尽管提呵，洗耳恭听

微笑流滢

回复 yangcy-smile 的帖子4 U  e$ N/ j' ?! l: G4 u' V

$ ?) A3 R- u. _8 E: ?5 H呵呵，还是谢谢了

yangcy-smile

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( e( g9 W$ F0 w
7 T9 L$ F4 C2 w5 u确实很棘手，我也被搞迷惑了。

微笑流滢

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. |. _" f$ A7 n8 W4 M! N5 i; p" K$ y呵呵，是真核表达 用的pcDNA3.1(-)质粒，条带都在一个位置，所以很郁闷啊，按理说应该对照检测不到条带啊，这个先不说，关键是蛋白水平检测到的高表达克隆，他的mRNA水平很低呀呀呀呀呀

yangcy-smile

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/ m$ t, p$ z0 l8 n5 H我有点迷糊，你做得是原核表达？

微笑流滢

回复 yangcy-smile 的帖子1 x  }9 l" f- y- N: ]8 K% K

$ ?! o0 X, s$ N4 d恩恩，条带都在一个位置，用了专门针对外源的引物了，可是还是不行，我上次挑了4个对照和8个过表达克隆，Western检测到几个克隆过表达目的基因，可是用RT-PCR验证了下，和蛋白水平完全不一样

yangcy-smile

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: J2 F9 F! F  F5 M# h) z4 @4 }/ E. U6 A
首先关于不一致的问题我的理解有两种：一是RT-PCR可能就有误差，最好进行三次独立的实验。二是假如你设计的引物是针对目的基因的，RT检测的是外源加内源，蛋白检测的是外源的  这个会出现不一致的情况。还有假如你用的标签在载体上，目的基因比较小，也有可能出现对照中都有的情况吧 ，你对照中出现的条带位置与实验组一样么？
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