G418筛选细胞，为什mRNA水平和蛋白水平不一致呢？很是郁闷

微笑流滢

而且重组质粒上有His 和Myc标签，用这两种抗体检测时，对照里面也有，郁闷郁闷，问问大家有没有这种情况? 求分享，感激不尽，是我原先筛的克隆不彻底吗？需不需要进行二次筛选？! E2 A, t4 E* s3 G4 h! A( B

yangcy-smile

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' }4 z( B0 ]8 [; G) E首先关于不一致的问题我的理解有两种：一是RT-PCR可能就有误差，最好进行三次独立的实验。二是假如你设计的引物是针对目的基因的，RT检测的是外源加内源，蛋白检测的是外源的  这个会出现不一致的情况。还有假如你用的标签在载体上，目的基因比较小，也有可能出现对照中都有的情况吧 ，你对照中出现的条带位置与实验组一样么？9 E9 b, H( n- l; \: B- i

微笑流滢

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9 L( B/ m+ Q+ X, f) S- }
恩恩，条带都在一个位置，用了专门针对外源的引物了，可是还是不行，我上次挑了4个对照和8个过表达克隆，Western检测到几个克隆过表达目的基因，可是用RT-PCR验证了下，和蛋白水平完全不一样

yangcy-smile

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2 c6 ~+ m5 ^5 ?
我有点迷糊，你做得是原核表达？

微笑流滢

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$ J1 v. Y8 m# e9 H) M* r" y呵呵，是真核表达 用的pcDNA3.1(-)质粒，条带都在一个位置，所以很郁闷啊，按理说应该对照检测不到条带啊，这个先不说，关键是蛋白水平检测到的高表达克隆，他的mRNA水平很低呀呀呀呀呀

yangcy-smile

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确实很棘手，我也被搞迷惑了。

微笑流滢

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1 C  J* O1 Z, }! ^- U; g3 p呵呵，还是谢谢了

微笑流滢

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7 ?# w! X; D/ f3 F, |3 B6 E' v( F我筛完克隆后剩下的细胞还保留着，我是再复苏起来继续筛呢？还是再重新转染呢？有什么好的建议吗？？尽管提呵，洗耳恭听

yangcy-smile

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6 d( \* p2 {9 T0 w/ F. U: a我师弟在建细胞系的时候遇到过这种情况，他也是筛到最后细胞成了克隆，怎么筛也不死，但是并不都是阳性克隆。我觉得首先确定自己构建的质粒绝对正确，没有空载体的存在。然后转染建稳转时拿什么都不转的细胞来做阴性对照，只是在筛之前对转有质粒和空载体的平行细胞组进行检测，看是否表达，然后确定表达后再对平行转染质粒和没转染的用以前摸索好的G418浓度进行筛选，基本达到阴性全部死亡，阳性克隆存留，这样再对建成的稳转细胞系进行RT或者Western检测时用没转染的细胞做阴性对照即可。一点拙见，可能帮不上忙。

微笑流滢

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+ d# u* |6 x9 D. Q! h嗯，老师也建议我这么做，太感谢了