DC-CIK细胞的制备方法 - 免疫细胞治疗专区干细胞之家



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发表于 2013-8-1 01:58 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

【背景】7 x0 N  J6 i& T# c
      CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。' ]! J4 W3 N8 P" u
  8 f# Z0 y+ Y% `. H/ g4 P
      DC是“DendriticCells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
  + e. N! Q! e1 |; b8 @5 w+ p# r7 V
      DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
  0 `% |' f. l8 T- C% \' ]1 z7 r0 }
【培养原理】
1．DC培养用细胞因子：* e# D4 \' ?' h1 m+ G' k

•  GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：
            GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细
      胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。9 D+ K, U/ b3 \+ X* j8 I

            GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，% L. H4 I- c+ p1 D% Q
      从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。' S  `  p4 Z7 X, o8 E( d
• IL-4 (白细胞介素-4)' }& d: P6 T+ X; P
               IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向
      分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能& R1 J+ G2 A( n3 ^. b' k6 b
      力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。

            GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取
      和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不" _* s2 d- g. W1 u, B% {
      表达CD14。3 d: T3 h8 P9 v5 O
• TNF-a(肿瘤坏死因子-a)" C2 s9 K$ C3 a
               TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II    9 |$ V/ {2 m, {# U! Y) @: G2 s
      compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟
      DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的
      激活T细胞。' W5 d( e3 ]) d

2．CIK培养用细胞因子和抗体：  • CD3激发型单抗：
               T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈
      的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表
      面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的
      辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使6 ?  T+ D  E) k* B9 v. C
      CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸6 O" g/ R3 q5 z/ f$ l. |$ ?
      (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇* B; t5 Q; F+ S4 {2 O" P9 w0 N
      途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(
      如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。1 O7 S& H9 v' C  T6 z. o

               由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子
      特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激& c9 N, z6 b# d0 q3 X$ z$ G7 T8 ~( B. @
      活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，+ V1 v6 {2 n6 q, X7 N. }( L  ~1 k( W5 G
      从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 ( v8 ^5 J: b  _. @

               此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺; C7 B" s$ E# d% m4 A
         激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养' [4 W* T( V: L8 L# m
         时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。& {6 |0 |7 M4 ]! v! j  k# Z
• IL-2 (白细胞介素-2)
               IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2 P7 O* {3 S5 P% a# U
         2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞3 f7 t! ]7 _! O: c( ~# M6 S
         活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加% G9 D6 }: O: S  _
         IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
• IFN-g(干扰素-g)$ m" i1 x( ~7 I! Z: C) C6 |! w7 e
               IFN-g;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强' x4 I# e7 F$ Y1 y8 E2 Q1 O# H0 m
         度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活
         性密切相关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。/ u4 G* i+ I( X; l* y
• IL-1-a (白细胞介素-1a) 　* T* C" \3 [7 I2 k/ \, k; R( {0 n
               IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显1 l- L# x; @' Y6 |, o
         提高CIK 的细胞毒作用。) q/ N+ u( T# w: x# Q) C  r, p

【细胞制备】5 R2 D0 `3 V7 X& b1 O) K; ^- W
1．外周血单个核细胞的采集
      1.1    用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；  \( }" @! `) T3 y$ y+ A4 e
      1.2    淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
      1.3    无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。! b3 s% L' n4 E  u
3 U/ B' }: p2 X5 z5 r+ r! R8 w3 D: p
2． (可选步骤) 肿瘤抗原的制备 * ]0 a0 D7 v$ S+ I' b8 P
               用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-
      Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
  / H- |) G9 u, H1 o4 X0 O
               用TSA或TAA负载的DC具有很好可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，7 G6 O" K9 J4 U' U, |# H/ ^( O
      而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆，从而1 R. q. [; b+ u! s
      实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
; K8 o" q% g* o+ q
               肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或
      死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞! Q( t% p% N. i) t# U* c: E
      裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
  $ Q2 p' X7 B' Q% @
               反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
      2.1    手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；( u9 y( P, i, _) W: o
      2.2    无菌生理盐水洗3次；+ e0 c  Y, V7 I; i) C4 _* d% n
      2.3    用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；8 M  c* P: H' |+ S; F: v; a+ u( l
      2.4    200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；- A( R3 b% t9 ~! l6 B
      2.5    用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
      2.6    将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；- C$ m( f5 T/ ?& S4 n% j4 E
               注：也可以-80oC/37oC反复冻融3-5次。" Z) P+ y/ L- w8 T* t
      2.7    将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；  g# L* r& h9 n
      2.8    收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；6 I! {+ Z: a& m! _3 h! Z* R
      2.9    -80oC保存备用。. K! Z3 d0 Z' H" `8 s" {$ ?
/ n+ Z9 L! v- p% @. q  X: X5 V
3． CIK细胞的培养及鉴定
      3.1    步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
      3.2    37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;/ {* D( y; j$ o7 V
      3.3    收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；* T. J! A- ~1 E1 \$ p# C
      3.4    加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；; j+ p9 w) B* w2 O
      3.5    24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；& m7 {/ g4 O  J. f2 e
                  注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
      3.6    每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；  _' r2 q$ N: C; l
      3.7    在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。
      3.8    CIK细胞质控：
               3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；5 y5 i5 p) c2 p: |
               3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明
                           显提高。5 u) G6 ~# U+ Y( }; c; S# X! D7 o

4． DC 细胞的培养及鉴定
         4.1    步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人
                  IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
         4.2    每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；0 L2 M' u  Y) c1 q% N
         4.3    (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；. Q1 n$ A8 @' g; K6 r% r8 [
                  注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。
         4.4    在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；' t& k2 l4 S, n  D  q/ M
         4.5    在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；- k. T6 a7 e3 K9 W% `* l
         4.6    DC的质检：% X: Y, W  o, d' L; I; [/ y1 C3 K
               4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；1 s# ^5 k# @6 Y0 r+ _
               4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。! V1 V( }% ~3 p3 `

5.    DC-CIK细胞的制备和质检7 O; y  m$ h" i0 A
         5.1    收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添
                  加重组人IL-2 (300 U/ml)；
         5.2    每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
         5.3    在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
         5.4    DC-CIK细胞的质检：
                  5.4.1    台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；$ x; {6 e& [8 f& k/ j
                  5.4.2    流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%
                                 以上。
                  5.4.3    细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
                                 细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 104. H# c, `# N- ?# A, J" |9 a
                                 个，终体积为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检
                                 测效应细胞对靶细胞的杀伤率。, _$ v0 f* C7 `2 _! Y
                  5.4.4    收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病
                                 原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。

版主加注：不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。（四楼aidiulgy9517异议，尚需进一步确认，请大家跟帖讨论该问题） $ b# ~2 y5 A- m4 e: D' Q; s
  【步骤简图】

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