DC-CIK细胞的制备方法 - 免疫细胞治疗专区干细胞之家



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发表于 2013-8-1 01:58 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

【背景】8 x7 W7 Z/ Q% V! P- R2 j# w
      CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
    U  H4 ?! Y3 @: p  {- A
      DC是“DendriticCells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。5 k: |, _" W- j

      DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
    F, W7 @+ {' y) C5 i/ @3 o$ n
【培养原理】* m* M; b% z* k; }& g! U( Z
1．DC培养用细胞因子：

•  GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：. H% \, M# e9 l7 L6 a
            GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细: X  P9 J$ [+ Y% `( u: n8 U2 J
      胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。3 s9 j# D7 Q+ ]$ W; E+ E4 T6 D
  # t/ l, R+ f- Z" c( ]
            GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，
      从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
• IL-4 (白细胞介素-4)5 B. Z) C) A- e! [
               IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向. r& b* G0 ^% v4 ~/ \7 `: K
      分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能
      力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
  ; G6 |, ?  K, r# Z
            GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取
      和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不
      表达CD14。
• TNF-a(肿瘤坏死因子-a)
               TNF-a可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II    7 j& O2 s6 U4 [% D2 {0 z
      compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟
      DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的
      激活T细胞。
  7 D1 ~" d2 b' y
2．CIK培养用细胞因子和抗体：  • CD3激发型单抗：( z/ q, e4 r. Q1 C. V
               T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈4 S* @% F9 Z2 T2 D
      的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表, f- I( w, I! V8 I' D7 s
      面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的
      辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使- ]0 K5 N/ M0 Y( J( E6 z
      CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸
      (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇% i2 {6 j$ Z1 _+ t. S3 x
      途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(: k. F0 g$ z8 U; b5 D
      如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。7 D3 M' A  c# h# H3 g+ g$ }
  , t+ M$ @! \4 ~" Y2 A- O& T/ H$ ~
               由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子
      特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激
      活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，
      从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 $ x/ W: N1 e  ~3 F/ o+ E
      2 M" t7 t$ n0 u
               此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺
         激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养
         时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。% u9 W7 T; c9 q, @
• IL-2 (白细胞介素-2)
               IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-% F* {# q9 c# i9 t) ~$ j
         2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞
         活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加: t- u& R% D+ ?7 s; x; q8 X
         IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
• IFN-g(干扰素-g); J* k& W) j0 }. q: m
               IFN-g;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强4 g6 r5 z0 |3 p" j8 r* g
         度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活
         性密切相关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
• IL-1-a (白细胞介素-1a) 　
               IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显
         提高CIK 的细胞毒作用。& l0 o7 F8 P+ G& S+ D

【细胞制备】! [/ x" Z) |! q; }
1．外周血单个核细胞的采集) _7 O+ {: V% v) j# ]. r
      1.1    用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
      1.2    淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。' U+ r* {- p5 y2 ^8 I# |
      1.3    无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。

2． (可选步骤) 肿瘤抗原的制备
               用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-
      Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
  ; X/ f% J$ Z% n
               用TSA或TAA负载的DC具有很好可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，
      而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆，从而
      实现对肿瘤细胞的有效杀伤。8 v( r& G3 O! q. h* @- x% ^

               肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或& t, ^9 ~) L& E, V
      死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞
      裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
  7 E- O! r3 a: b" ~; ?( \8 s
               反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
      2.1    手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
      2.2    无菌生理盐水洗3次；
      2.3    用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；: }9 h2 P5 [2 h) s6 L
      2.4    200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；. o: ?  Q% q% \, S7 e# k) H( f1 ~
      2.5    用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
      2.6    将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；
               注：也可以-80oC/37oC反复冻融3-5次。
      2.7    将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
      2.8    收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
      2.9    -80oC保存备用。1 U/ j: K' N) e
8 E" ]+ Z( ^/ E3 U6 H' [
3． CIK细胞的培养及鉴定3 j4 d) d1 p+ J9 t5 e
      3.1    步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
      3.2    37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;" C4 K9 E; d1 F7 b0 v
      3.3    收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；
      3.4    加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；) O- Q7 K% }/ O8 b% h) S
      3.5    24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；# {* ~5 `3 B  c' V: O' Z
                  注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
      3.6    每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；, V' j/ X* j: ]8 v& l$ Y, s" a% k
      3.7    在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。  p7 @6 D. z4 S; B0 {" P
      3.8    CIK细胞质控：+ o4 H* v1 z9 J$ `% e
               3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
               3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明% G; z! Y. R( U+ Z% W
                           显提高。# B' a' B* ?2 j4 r1 K
  , t1 z0 z" W( K5 q) e  `1 _1 h! u) Y
4． DC 细胞的培养及鉴定
         4.1    步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人' r' A7 l8 A& z. g7 y" b+ n3 O6 }' I
                  IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
         4.2    每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；. {& s. V! M: N8 G' c
         4.3    (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
                  注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。
         4.4    在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；7 L! _; y8 ?; [. |2 }3 Z) g- q( N2 \
         4.5    在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
         4.6    DC的质检：
               4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
               4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。3 Y0 f1 y9 Q/ i# W
  & `$ Y7 @, X  r) O: g" E+ b
5.    DC-CIK细胞的制备和质检/ |0 p5 ^" X; r
         5.1    收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添( m5 }5 m' f' m  x- r# x$ T; R
                  加重组人IL-2 (300 U/ml)；
         5.2    每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
         5.3    在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；2 y9 h" L( g$ X% Q, e4 d
         5.4    DC-CIK细胞的质检：
                  5.4.1    台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；: g- B/ S/ n' Z9 Q3 k/ K. Q
                  5.4.2    流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%% n" @$ I7 n2 @" q* n
                                 以上。% h9 |* z' u; l. F
                  5.4.3    细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
                                 细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 1043 k( p9 r& Q1 K5 Y& P4 o; m
                                 个，终体积为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检; F$ l* m/ V; L9 v$ ]1 E
                                 测效应细胞对靶细胞的杀伤率。5 H+ p* h9 `; k9 ^) @. t
                  5.4.4    收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病9 f8 c5 g7 v; Y* n; `( O, ^
                                 原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。) Q( Z, f+ ]  h0 t
: X  W& ^. f1 C1 P/ [
版主加注：不过文中IFN-g(干扰素-g) 似乎应为 IFN-γ(干扰素-γ)，象简图中注明的一样。还请版主予以确认。（四楼aidiulgy9517异议，尚需进一步确认，请大家跟帖讨论该问题） 5 I5 k1 `- }7 I/ ?, G$ f
  【步骤简图】& _3 x1 @$ m+ G0 _. C9 J* W: w

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