构建质粒酶切

ningtinglu

设计引物时在引物的5‘端加了酶切位点保护碱基，酶切过夜都切不开，后来只好连的T载。但是一直困惑为什么切不开，大家帮忙分析一下原因，有什么办法吗？谢谢

gscao

酶切体系太小，试试50ul-100ul，甘油浓度不超过10%

xiehuangfan

酶是由甘油溶的，比例过高会影响酶的活性，一般酶的体积不要超过体系总体积的10%。

jlucute

你可以看一下是哪个酶的酶切效率不高

chenhuachen

小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响，急求TET四环素诱导的wt-p53质粒，对接下来的实验非常重要，跪求论坛里的园友谁有这个质粒，可否赠小弟一点，不胜感激！6 I$ u# G/ W" U$ j6 d3 F9 v
人的或者大鼠的野生型p53都可以。

moonison

楼主所谓的切不开是不是没有克隆啊，然后用T载体就有克隆了，这个和很多因素有关的。不一定说明没有切开，也可能是酶切效率不够高，毕竟T载体没有酶切效率的问题，连接自然也好做一些。酶切效率不高可能是体系没把握好，酶有问题，buffer有问题之类的。

ningtinglu

回复 chips100 的帖子
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这个都是按网上的加的，应该没问题吧

ningtinglu

回复 yaolinzhang 的帖子2 }5 Q$ `2 j1 V- O: C
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不还意思，这两天有事没来的急回复。酶和buffer都是NEB的，体系是10ul的：酶各0.5ul，1ugDNA,1ul的buffer，水补齐到10ul

chips100

保护碱基不够长？

yaolinzhang

回复 ningtinglu 的帖子7 t9 V+ M$ n8 m. e9 |" p9 _( |- u
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不知楼主的buffer和酶是否是同一公司的？酶切的比例是多少？