构建质粒酶切

ningtinglu

设计引物时在引物的5‘端加了酶切位点保护碱基，酶切过夜都切不开，后来只好连的T载。但是一直困惑为什么切不开，大家帮忙分析一下原因，有什么办法吗？谢谢

yaolinzhang

回复 ningtinglu 的帖子! Y: p& g" R3 t0 j

2 u" \3 u0 c! i9 _3 v+ ?我能想到的原因有：
4 m! q0 F4 b5 g' q' ?* f# s1.两种酶的buffer使用不合理；
0 U4 U/ @& j7 P6 e; w$ G. M2.酶失效；! [- L7 Y6 F" D( d
3.酶切位点有影响
3 H) |7 \, N+ `$ m! x1 X  Y8 G! {        不过3的可能性不大，建议楼主检查一下buffer，也可使用不同公司的酶试试；另外，先可分别单切，看看结果，再双切。

ningtinglu

回复 yaolinzhang 的帖子
0 V0 h- x3 M. l5 n
$ V; O2 N+ f7 M8 r两种酶都是NEB的，在NEB官网上找的buffer，连了T载后相同体系可以切开。1和2应该都不是原因，保护碱基是在网上找的不知道会不会影响

yaolinzhang

回复 ningtinglu 的帖子( W# P: N4 V9 e8 E" ^3 R
' V! k) T6 p/ k- J  G  `
不知楼主的buffer和酶是否是同一公司的？酶切的比例是多少？

chips100

保护碱基不够长？

ningtinglu

回复 yaolinzhang 的帖子% I  m! F. E8 d

% C. v' n1 ~0 s! k& q2 l不还意思，这两天有事没来的急回复。酶和buffer都是NEB的，体系是10ul的：酶各0.5ul，1ugDNA,1ul的buffer，水补齐到10ul

ningtinglu

回复 chips100 的帖子" h6 w$ I6 n% H7 A' @. E' T3 A0 D" e, b- `
5 p/ U7 D6 \7 R1 q" U  D
这个都是按网上的加的，应该没问题吧

moonison

楼主所谓的切不开是不是没有克隆啊，然后用T载体就有克隆了，这个和很多因素有关的。不一定说明没有切开，也可能是酶切效率不够高，毕竟T载体没有酶切效率的问题，连接自然也好做一些。酶切效率不高可能是体系没把握好，酶有问题，buffer有问题之类的。

chenhuachen

小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响，急求TET四环素诱导的wt-p53质粒，对接下来的实验非常重要，跪求论坛里的园友谁有这个质粒，可否赠小弟一点，不胜感激！: n' k' L8 t9 O- E* t
人的或者大鼠的野生型p53都可以。

jlucute

你可以看一下是哪个酶的酶切效率不高