引物设计是否正确

小兔子lp

' y/ Z0 L% j2 Z$ i3 A# f: T+ P

3 N4 B% v" k; {! y& ~& ~提取了RNA，反转后想扩增Pdx1基因，之后连接到病毒表达载体包装病毒。pdx1的CDS序列如下：5’-ATGAACAGTG……ACCCCGGTGA-3’。5 q) P7 P; A1 Z* Q0 ~
上游引物直接设计为：5’-ATGAACAGTG]-3’
6 O0 D' m% l4 ^8 t' f下游引物直接设计为：5’-[TCACCGGGGT-3’(ACCCCGGTGA的反向互补序列)3 z  d0 j# y0 W% h$ {: D7 V5 l
请教各位，这样就可以了吗？这样设计就用不到PP5软件了呀！

murong

Tm值和加了酶切位点后的Loop Tm值都要用软件看下多少啊，上下游Tm值差异最好不要查过5度，loop Tm值最好不要超过40

小兔子lp

- ^3 N, |: I% |: u- g- l$ P* M

) A/ q# M$ l! `回复 murong 的帖子
6 ~" m4 r  ^  @8 Q" ]0 `# R/ p* N- e4 p
验证引物是否可用是确实用了软件，可是在设计引物时就用不到软件了呀~我将CDS区复制进PP5,软件设计出的引物和我手动设计的这个也不一样啊，这是怎么回事呢？望指教

biovictor

回复 小兔子lp 的帖子
, Z4 ^- a, L! N6 ]6 O  V! _# l1 Q7 b, d) P- l1 |
妹子呀！设计引物重点不是看你能否将设计的引物正好配对上去，重点是要看如下几点：/ q/ [$ r4 e6 U- [9 K+ @: O
（1）希望将自己的PCR产物连入载体中，是不是要解决酶切位点的问题。如果不用软件，随便弄两个酶试一下，万一他们的识别位点在你的基因序列之内，怎么办？那不就切烂了吗！
9 X! b3 T- k/ n* j0 b- }) N（2）不用软解分析，假如使用的酶在序列中没有酶切位点（走大运了！），但是保护碱基添加的数量或者酶切位点序列的添加不对，造成移码突变，等你连到慢病毒载体上，就是不表达蛋白，那就洗洗睡吧！6 G5 F/ ?* V# _% x/ H. y* L1 G; n
（3）万一自己的实验需要某种标签，来指示自己蛋白的成功表达，可惜妹子没有在意基因序列之后标签蛋白的感受，自己弄一个就可以了，如果造成后面蛋白移码突变，标记就在也不想理你了！所以要学会使用它呀！可以多问问你的师兄师姐。