求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

2013sp

求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

490096812

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* H6 W6 [' ?+ [
. m3 Y% M* K& C9 N/ B, X: c5 a的确是，这也是研究的一个瓶颈。但是采大猪的样不好采啊，人家都在7d以内就阉割了

w343989328

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- J0 ?+ U8 N5 q, j6 _$ S8 ^
2 a3 j! B" f  s" r刚生出来的小猪，算是gonocytes不是spermatogonial stem cell吧

490096812

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) ]( n( V3 ]& y5 r$ A" e- q! G9 d
+ b! ~, I3 |6 K  G! k! d. ?, s8 H越小的越好吧

w343989328

回复 490096812 的帖子2 e) c& Z! ~' [5 O) m7 Y

+ x4 i+ K6 B* L+ L你们取的是多少天的猪的睾丸

小咪咪

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3 D2 I" [* m# P4 b/ C
+ r% y) B# o4 [6 o详细步骤你可以参考楼下的，我觉得他写得挺详细的。
# D/ c+ J6 d( e1 }: R  y注意事项：1.保证整个操作过程中不要污染。0 Z% ^9 t2 o  Q" q, [4 o
                  2.所取睾丸不能太大，3-5条较好，保证能够取到细胞。4 A& j6 g: c" s- v5 k
                  3.Dnase消化时间不能太长，否则取得的细胞也会很少。' J% c. \) u& T5 ?3 m

490096812

给你个流程吧：
0 Z/ ?4 z* Y( y8 r1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。
2 K/ ]9 \& k8 R9 f  d! ]" ^+ A2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。. V! \+ D: D# X$ N3 R5 T+ D" c! B
3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。
( P5 m" s' }* _; b" K5 o) V4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。7 p- F& v& g" |3 M! @& }
5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。0 c" r0 G6 O% @
6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。
+ M. v6 R. g/ X6 n: w( Y7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。
% l& Q0 n, q* q+ c5 l8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。
. E, j1 C3 x3 Z' e- k9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。
+ `" ]5 [# b) ^7 J+ F" E! f10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。
$ _$ M  `, K/ O, Y# s; ~) \, N11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。
: ?- Q. }. }! z8 t) Y9 [12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。
7 f  \' e4 W8 g9 i* H* e13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。
; Z( e- ~0 Z7 m14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。7 K" C2 `) T  m( Z2 |, a  \
15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。+ J8 c/ [! L7 W# d! k; N/ F& l

2013sp

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$ E( j1 A( p; M. J
( I, E! b4 i5 h8 ]' r能提供详细的注意事项吗？
% f. A- S! h" G# e5 Z

小咪咪

简单的就是：剪碎-消化-过筛-培养。这样就行了~

biovictor

我只做过一次，猪的不好养呀！后来就放弃了。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。