求助群友。。关于胚胎干细胞的核型分析，染色体纠结了。。

piaopiao

本次实验步骤汇总：选取T12孔培养板其中的3孔细胞量入秋水仙素，终浓度为0.30μg/ml
  U7 v6 H. H2 r: ?' Q! M8 }2 D培养时间约为4h。
' i( t" K$ V8 N7 K* Y, N7 bEDTA消化，吹下细胞约2ml，将细胞及溶液转移至15ml离心管，1100r/min 9min
8 V: A' M8 j/ Z( R* q加入已预温至37℃的0.075mol/L的KCl加柠檬酸钠低渗溶液10ml，充分混匀，置于37℃水浴锅约13min，中间时间段再用滴管轻轻吹散。
4 {- w; b) y8 h6 E% _低渗完毕后，加入新鲜配置的固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）1-2ml，轻轻混匀，进行预固定。（时间约为3min）
2 Q: {+ V3 x2 @: ]1000rpm离心10min，弃上清，加入固定液10ml，轻轻吹打混匀，固定30min。/ J5 K5 \) _- g% S, z! S
1000rpm离心10min，弃上清，加入固定液10ml，轻轻吹打混匀 20min& j3 D3 o9 E4 e) }9 v' q- x- W: F; L
1500rpm离心，10min，弃上清。加入固定液2-3滴，约为0.2ml，轻轻吹打混匀成细胞悬液，滴片：将细胞悬液滴在冰水浸润洁净的载玻片（多聚赖氨酸 免疫组化防脱粘附载玻片），长纤维纸迅速搽一下，50cm~60cm滴片，吹开，让液珠在载玻片上走一遍，空气晾干，3天前配（为原液）吉姆萨染色时间为10min，3min自来水冲洗，用吸水纸吸取表面大液珠，电吹风吹干，于200倍，400倍，1000倍油镜下镜检。# {7 q# l" Y2 h* `& N

iseeyou1210

lz低渗液时间太短。我一般是室温20min，其他的什么37度，什么45度角滴片，20cm摔片都是次要的。

luyue6453

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. q7 O$ a5 m) ^1 H  a; ?0 t你加低渗液时，边加边搅拌，水浴20min。底片的时候倾斜45度角。离20cm距离感觉液体是摔上去的，自然分开，这样细胞才能分开，滴完以后，马上再火焰上烤一下，等液体都干了再染色，原液吉姆萨用pbs稀释，1:9。

Emma1986

低渗那一步没做好，细胞膜没破，染色体出不来。低渗做好了之后，接着还要摸索秋水仙素的处理，祝你完成漂亮的片子。

laner

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/ }8 ~+ ?' F: r( D' U% X( Y
/ U6 i) `3 W! w: N8 |0 Y0 C低渗不足，染色体分不开

细胞海洋

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* b8 K6 N; u. {发帖或者回复 高级模式 附件上传

piaopiao

图也不知道怎么传。。简单描述下，液滴旁边有很多染色的碎片，然后游离的单个细胞，染色体分不开，而且，都看不出染色体的样子都，不知道哪里出错了。。单个游离的细胞我是2滴一个载玻片，约在30个左右，包括不合格的，观察到的染色体还是粉红的。。。还希望指教。

piaopiao