求教：脐带间充质干细胞胶原酶消化后有大量细胞但养不活怎么办

edwardellen

做脐带间充质干细胞分离，脐带去除血管和羊膜，剪碎至小块，用同等体积的1mg/mL的Ⅳ型胶原酶消化2.5-3小时，加30%体积的血清终止，之后用PBS稀释4倍后离心，2000转10分钟，弃掉一半上清，继续用PBS稀释，重复离心，一共洗4次，可以收获很多细胞，大小上看应该是间充质干细胞，肯定不是血细胞，用10%血清的DMEM/F12培养基培养，血清是德国的，细胞第二天贴壁少，几天后很多死亡，只能残留很少一部分，形态也不太好看。这是什么原因，求赐教。: l/ a1 {) s% k3 o& I+ c* y
另，大家是如何去除红细胞的？每次我拿到的脐带动脉里总是有血，红细胞很多，要换两次液才能去除干净，红细胞存在对间充质干细胞生长是否有影响？: Y( ~5 ~8 l1 h  i5 i( d1 r1 ?) E, `
多谢多谢！

伊诺强

去除红细胞的方法，一般是将脐带剪成2到3CM小段，用镊子挤出淤血，用生理盐水洗净，一般情况会残留很少的！再取出血管和外皮。另外血细胞多肯定影响贴壁和生长！血细胞密度（质量）大、数量多，占据大部分培养皿的表面，自然MSC没有机会贴壁！个人看法，仅供参考！

edwardellen

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之前我没有清理血就直接去血管，下次我试试先把血清理干净，谢谢！

月_幻影

我们一般是拿到脐带后首先用加双抗的盐水将外表的血污洗净，并用镊子挤压出血管内的部分残血，然后剪成小段后再次清洗，并尽量将残血挤净，最后除去羊膜和血管；另外LZ的细胞死亡是不是跟转速有关系？感觉转速有点高啊、、

edwardellen

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  n1 z/ A( M3 k6 o9 i谢谢！还想请问一下，您做的时候转速是多少啊？我以前做过1000，但是感觉细胞有点下不来，可能是就是胶原酶消化以后的液体特别黏。我看有人用透明质酸酶再次消化的，请问您试过么？

flylover1221

已经有人说了，红细胞尽量去除干净，还有就是消化完以后我们会过筛网，滤去未消化的组织，离心是1300rap,6min，4℃，希望对你有所帮助。

azzyou

先用酒精洗一下，用生理盐水洗个三次，能洗掉很多血，剩下的换液就可以换掉了。  s1 }! _2 ?; l5 ?; |  Q9 M" p

a352167963

回复 edwardellen 的帖子  q5 T% C+ x4 h0 X5 ^

( {' D% Q& |9 C3 Q- }建议你缩短消化的时间大概40分钟左右试试吧

a352167963

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3 e" ]0 ~2 N' }" ]/ Q8 I9 A& f37度40分钟左右就可以了

edwardellen

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8 J$ B6 Z: Z# I& R. }8 Q  [谢谢，请问你们过的是哪种滤网？我这有铜网，可以么？