胚胎干细胞向心肌细胞方向诱导问题

Jonathan

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% l9 D& H( A- ], r% K! f4 z
! l+ z  Z0 l5 P想问问你这个protocol效率如何？

Musing

你这个现象显然不正常。
5 a( l$ z: V& e$ T7 }, _分享一下我们实验室采用的protocol:% u+ n  x3 c  _. Q! m3 j1 D8 M
通过EB途径将hESC定向分化为心肌细胞。
5 t8 ]% s4 [9 i8 [2 f8 q$ J1. 心肌分化前细胞培养的准备
/ s, Y4 c: J) T0 s( T+ P: I. n（1）在开始分化前，hESC至少在标准密度（0.75×10^5个细胞/ml）的MEF上传代3次。2 v; V' X1 |4 d) w8 s3 P
（2）在EB形成前1代，hES细胞需传至低密度(0.5×10^5个细胞/ml) MEF上培养3-5天。
+ e8 b3 q1 T" \5 u2. 心肌分化第0天/ t) v* t2 W3 y0 `; _
（1）待分化的hES细胞培养3-5天后，用分散酶/胶原酶Ⅳ消化。
% O/ k8 K6 R$ g（2）将培养板置37℃，5%CO2培养箱孵育20-30min，直到轻摇培养板所有细胞克隆从培养板上脱落，漂起。
$ Y6 c) n2 e; k) E6 X1 R. p& b（3）用1000 μl大tip将细胞克隆轻轻吹下，尽量保持克隆的完整性，将漂起的克隆吸入15ml离心管。
& Z7 N" b! Z4 J" f; F5 G（4）毎孔加1ml EB20培基冲洗培养孔，并将其吸入15ml离心管。
' U- s# J8 Z. I& U; ?3. 心肌分化第1-3天( i/ X7 c$ F" F8 p# u
（1）第一天，将培养板内EB吸至15ml离心管，自然沉降2-3min后，小心的吸弃上清，再加6ml EB20培基重悬细胞。, k  U; T( d( T% {# U: q" Q; h
（2）在低吸附6孔板的每个孔加4ml EB20培基，然后毎孔加入（1）中的细胞悬液1ml,最终培养体积为5ml。
8 P" ~/ x, A: b2 `4 c8 b) O（3）继续悬浮培养EB 2天，无需换液。; {! z+ w1 s% E# H
（4）在第3天，准备0.1%的明胶包被培养板，室温包被过夜。, s& Z( p3 w" r* s& A4 G
（5）将细胞克隆在重力作用下自然沉降2-3min。
. j3 x! N, e) R（6）轻轻的吸弃培基，用5ml EB20分化培基洗涤细胞克隆，至少洗涤3次，每次都让细胞克隆自然沉降。, s4 o! W$ B# M; r8 ^
（7）毎块6孔板的细胞克隆加6ml EB20培基重悬细胞。! }- r. s/ C) v" N
（8）在低吸附6孔板的每个孔加2ml EB20培基，然后毎孔加入（7）中的细胞悬液1ml。2 s8 J! L1 I  i7 F
4. 心肌分化第4天
; Y3 E% {0 z  b（1）将EB从低贴附培养板吸至50ml离心管。
( G* q# T4 o0 w, Q* Y  f0 k2 X8 ^（2）将6孔板的明胶弃尽，毎孔加入EB悬液1.5ml。# o6 T+ g5 i) M( O, j, ?1 ]! X
（3）毎孔再加入1.5ml新鲜的EB20培基，轻摇培养板，使EB均匀分布于培养孔
& j4 n" G5 w! |5.心肌分化第5天1 W/ i- [$ E) m
    每个培养孔加入1ml EB20培基。
4 e3 F, U8 n8 w6.心肌分化第6天7 v$ G5 G+ W, S& D$ J) g' W4 k
    吸弃原培基，毎孔更换3ml新鲜的EB20培基。每天都更换培基至分化第10天。8 r! N  ?! W/ S8 Z# `6 r
7. 维持培养
5 I7 }1 g- p$ @% {: t   EB20培养基用于EB形成的前10天培养，然后用EB2培养基维持EB的培养；前20天每天更换培养基，20天后根据EB的密度适当减少更换培养基的频率。在心肌分化的第11-15天，陆续可以观察到类似心肌跳动的细胞克隆，且数量逐渐增加。
( i3 w( U2 W: _0 X2 K
( A2 k+ h2 I% _: K6 c培养基配方：
, }8 z  P8 w9 M% q/ ^. |0 s1.  EB20分化培养基
, v4 t) `1 f# M! [& T2 }DMEM/F12                       392.5ml
- d; y8 G/ L+ G$ R) s( A; _1 |FBS                               100ml' S3 w, X7 i( |5 a
200mM L-谷氨酰胺                  2.5ml+ J: z0 L& \. d" ?2 `5 F8 |: {$ z
β-巯基乙醇                          3.5μl) D& k2 a+ N0 {& I6 l
非必须氨基酸                         5ml$ t- w5 c! N% k6 q* c$ J' U
# C% G4 j5 V1 b7 W7 k* o
2.  EB2培养基（500ml）
+ t2 n5 r# e2 a8 }DMEM/F12                       482.5ml( x- N9 x- G% _" K; u8 ~
FBS                                10ml/ D1 k: p7 O, _, a8 p, D
200mM L-谷氨酰胺                  2.5ml! j( B# Y5 u* g3 b/ I7 [
β-巯基乙醇                          3.5μl
& L  u* B! I% M6 }) A5 o非必须氨基酸                         5ml
1 B% v" S9 v& h/ g

细胞海洋

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  {5 f) Y+ ~; A. s
: H0 J0 w$ o( O/ ~" L, V# M8 p* D+ a. h$ i1 d  Y% U" R
你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样$ K0 S$ _/ ]" |$ B- y; E2 S6 U8 ]

/ r2 A8 H: s6 q+ O1 c1 k否则他会看不到

redmaple

你的胚胎干培养多少代了？

智露

不是啊，我以前悬浮5天都是圆的，现在边缘有点分化，是什么原因呢？

Jonathan

分化不正是你需要的么