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你这个现象显然不正常。
. o5 N7 ]& B, {: b: @: c分享一下我们实验室采用的protocol:) w6 Q2 T& \( N( X1 N A
通过EB途径将hESC定向分化为心肌细胞。1 N+ n8 {1 b; d0 A+ J) q
1. 心肌分化前细胞培养的准备
1 V. _1 z* q9 P（1）在开始分化前，hESC至少在标准密度（0.75×10^5个细胞/ml）的MEF上传代3次。4 t1 i; m p8 |# ^# n
（2）在EB形成前1代，hES细胞需传至低密度(0.5×10^5个细胞/ml) MEF上培养3-5天。
! X$ k9 V: v+ Q2. 心肌分化第0天5 e" A1 s% p5 H% s4 C8 O
（1）待分化的hES细胞培养3-5天后，用分散酶/胶原酶Ⅳ消化。
, }0 B8 s2 m b6 h1 N! d（2）将培养板置37℃，5%CO2培养箱孵育20-30min，直到轻摇培养板所有细胞克隆从培养板上脱落，漂起。
- L* T$ A! ` @( `（3）用1000 μl大tip将细胞克隆轻轻吹下，尽量保持克隆的完整性，将漂起的克隆吸入15ml离心管。+ W8 s0 W1 m1 o# m; a+ |/ l, @& a$ _
（4）毎孔加1ml EB20培基冲洗培养孔，并将其吸入15ml离心管。
0 [* l2 t( R% m0 h) ]3. 心肌分化第1-3天
! v" N' j7 N$ X( m9 x（1）第一天，将培养板内EB吸至15ml离心管，自然沉降2-3min后，小心的吸弃上清，再加6ml EB20培基重悬细胞。
) s. l3 e8 F, L; Z. F+ R（2）在低吸附6孔板的每个孔加4ml EB20培基，然后毎孔加入（1）中的细胞悬液1ml,最终培养体积为5ml。2 N% h g# S$ w* F
（3）继续悬浮培养EB 2天，无需换液。! }: B/ q9 T5 q
（4）在第3天，准备0.1%的明胶包被培养板，室温包被过夜。
9 {5 h3 \1 y) A. b( h+ }! R（5）将细胞克隆在重力作用下自然沉降2-3min。
* Q0 u9 D4 T4 F1 G3 j6 Z（6）轻轻的吸弃培基，用5ml EB20分化培基洗涤细胞克隆，至少洗涤3次，每次都让细胞克隆自然沉降。: v: `; l) s1 H L
（7）毎块6孔板的细胞克隆加6ml EB20培基重悬细胞。
! o, w8 [+ T1 Z! W# [7 u（8）在低吸附6孔板的每个孔加2ml EB20培基，然后毎孔加入（7）中的细胞悬液1ml。, d! ~9 `' F. \& a) ]. g/ a% u( `
4. 心肌分化第4天7 g) R- t- X( j* _" g! i) D
（1）将EB从低贴附培养板吸至50ml离心管。/ x+ |& {; }8 `+ N3 i7 ^; ^
（2）将6孔板的明胶弃尽，毎孔加入EB悬液1.5ml。
+ r6 ?3 k) t7 N* S! h（3）毎孔再加入1.5ml新鲜的EB20培基，轻摇培养板，使EB均匀分布于培养孔, f: {9 f' x" w5 r& I& Y1 k
5.心肌分化第5天% Y3 c: `5 W7 E" j# b2 x. ^
每个培养孔加入1ml EB20培基。6 o! v! T, v) S2 K1 a+ X
6.心肌分化第6天
) r7 g8 \( }3 r" U; X4 ~ 吸弃原培基，毎孔更换3ml新鲜的EB20培基。每天都更换培基至分化第10天。
) A" A$ r, m; `9 U. m9 g( ~7. 维持培养, Y; v3 {# U4 W
EB20培养基用于EB形成的前10天培养，然后用EB2培养基维持EB的培养；前20天每天更换培养基，20天后根据EB的密度适当减少更换培养基的频率。在心肌分化的第11-15天，陆续可以观察到类似心肌跳动的细胞克隆，且数量逐渐增加。
( v1 [0 e, y3 V7 l
& O: }! r7 k" }! z6 p培养基配方：1 c, b! ^. t1 m; v$ a
1. EB20分化培养基3 {: h9 p4 c8 P3 ]$ P5 Y% C
DMEM/F12 392.5ml
' ~' u* C7 a! Z" a7 Z0 l ^FBS 100ml
' L/ d: z4 B+ k3 T; K200mM L-谷氨酰胺 2.5ml
, Y* h! M! ~0 F3 x: C. o: Cβ-巯基乙醇 3.5μl
+ D5 p1 F+ Y9 J, k1 D" z非必须氨基酸 5ml
; y$ }! K8 }" o: }) n( b1 ]4 Z& g
@ {! g) @ Q+ c0 W) N% V f( t2. EB2培养基（500ml）
1 A( b( Z* }" ?/ ?5 h6 S yDMEM/F12 482.5ml% S3 [; P# W7 s! p
FBS 10ml
% l y& a# \# d7 N5 g B7 d9 U% `200mM L-谷氨酰胺 2.5ml: @+ E1 P6 n$ {3 ]6 \& L0 [! d
β-巯基乙醇 3.5μl6 I* e. E/ T7 z& w6 d
非必须氨基酸 5ml6 n* W8 I p1 q! n: \0 _* P7 F
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发表于 2014-3-28 17:47
发表于 2014-4-1 07:38
