PBMC没有分离出来

thor0504

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$ l1 Z7 X( |6 \
具体的步骤呢？每步的离心力、时间、ficoll的用量分别是多少？有先分离血浆吗？

momoenn

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7 |- q, Q- T, w: `( O100ml，沉降加密度梯度离心

momoenn

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4 V. B3 o- A; A- Z8 ?; s0 r& A% Q$ n! \( h
我们用的是ficoll

thor0504

回复 momoenn 的帖子7 n$ d5 _; Q8 Z

. w$ u3 r8 _( @取血量是多少？按照什么程序操作的？用的什么方法分离的？密度梯度还是别的？

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39 ' l: @: _2 F3 e0 d+ r4 G/ [' s
今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

5 t9 ~: p$ ?! G! s) J- V6 U8 N能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！- D0 y* e0 B9 R6 O5 B
4 t8 [$ w( V+ {, m5 k. y" P
首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：
: v( q# y8 M+ S# ?& Q. s' v+ ?
一、        溶液配制
& f% Q9 u0 }3 A) g& d1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。
" Z% n+ q+ g0 _8 c3 Y2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释
* \3 C* V- P& W' M1 O3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液
9 f: \& m! y4 u+ [4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。" B! f. B( \# u4 _% L) h6 f
6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。" h' C6 F! m5 M  b
7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。
9 {8 t* T/ ~5 W9 b. a: D8、        6~8周龄雌鼠
* z% ^; J& p2 N7 i. k9 Y9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes
; C. d* S4 c, a/ d  F10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA2 M! g% h+ ~" F1 g  B
二 . 小鼠淋巴细胞的获取：  [/ I  J; I# |
1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。' w( G$ p7 W# o* h
2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。5 o7 U7 K6 b3 B0 J; c' b8 ]
3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。
  S8 C, h# j) J7 [( F5 ]- t4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。
  w/ {" {# a8 L5 ~2 q2 ^5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。
- i/ H* L7 p+ ?$ ~9 \6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。
8 i4 a5 B- p% B: k& y0 G' H- X7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。' b, C7 H/ ]# m. k) r3 n* X/ w
8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。
( d% k1 @5 u* D2 c& D8 a. k* m1 l9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。
  P4 y% m3 }  C( G0 n6 \10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。
6 ]7 A" Q9 G! V0 n1 i! \11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。
. \' ]$ w% c& I12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。
; O* ?, P( q/ ~7 \( L6 s' S9 V13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。2 }* x8 Q! ^% g, W/ }  W
  W5 x+ u0 H! N5 e" Y& q4 T
% p" l$ y4 b7 Z; ~2 l1 F/ a- P