PBMC没有分离出来

momoenn

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9 t, L. B, ], P( ^今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个核细胞。大侠们遇到过这种情况吗？在线等待。

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39 : t/ Z' T/ T" X$ u. \% x6 t
今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

( d/ D( l$ b2 v& l; O
能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！
4 X. c* M; T8 R& {7 y3 q+ e) X1 P2 ?- p) P5 M7 L
首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：  m* C3 U) a1 U8 S% L

, h) s+ O& ~& H2 I' w+ Q9 l6 m一、        溶液配制: {7 v, x" b: V" Q5 Z
1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。8 C& @6 G* }" _, d- x* k
2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释9 H9 `6 m; x  z6 H. ~2 o
3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液" A5 j3 \; r" a
4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。
: x" \5 S; H9 T6 F6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。
, D7 N  s4 B- F# Y+ z7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。
" y! V1 e1 b$ m* w! J8、        6~8周龄雌鼠
' R( w& t# Z, e8 v( J" h9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes. k5 c, i8 X. h& C6 H6 e
10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA
+ k2 E9 m; H' {0 O' B4 U. u" u二 . 小鼠淋巴细胞的获取：
* @" J( [5 B4 Y0 q) ^6 N1 }- \$ {1 M1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。$ |# l1 E+ |6 j/ }0 g( ^
2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。5 g( z9 e0 L6 A, V2 y
3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。
. q% d" |2 W+ c( o4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。' a1 v; m# e! }0 w
5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。7 u3 t4 J8 f' w! s- w
6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。8 P) f: @8 ]# F7 j
7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。
) [9 ?; n% n6 |$ m( ?8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。! }; b. I# n9 U, P
9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。
  `' R; j! n' t( W8 d: ~' L10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。
! {" M- n/ W" M11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。
/ z" E% v( m5 ?( ]& L2 s0 U12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。; x5 V+ r# O6 C
13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。- E8 P7 ?# y+ H( v, }2 }  p; X

( [# b1 n7 b6 }/ R! a6 P
8 ]8 u6 `7 c( p" X( j( C

thor0504

回复 momoenn 的帖子6 k% K- `9 l4 s, `3 m

# ~  Q0 ~3 Y' e8 Y$ a; ^& e取血量是多少？按照什么程序操作的？用的什么方法分离的？密度梯度还是别的？

momoenn

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. g* ^  F! M9 i) N5 Z$ f
6 o" \' z4 {1 C6 Y我们用的是ficoll

momoenn

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" w4 _' X: F# t
7 h1 |, m4 F: u; f' P100ml，沉降加密度梯度离心

thor0504

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. V* x$ E" z- h$ Y) }' S4 a! Y$ J* W2 y3 g/ P
具体的步骤呢？每步的离心力、时间、ficoll的用量分别是多少？有先分离血浆吗？

heirrii

100ml外周血，应该能分很多啊

heirrii

血液先稀释没

levell

血液细胞用PBS稀释后加入到淋巴细胞分离液上，离心，注意离心加速度调到最低，很关键，不然起步和停止速度过快就会把液面打散了
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weijunning

回复 momoenn 的帖子# f% H. q; o- L; r! T
$ q; L: u" Q5 ^1 t+ Y
请问这个病人是什么病人？如果是癌症患者，无动员直接从上肢静脉抽血，很难获得足够数量的PBMC，有的血象差的病人基本上分离不到白膜层。所以，建议还是先动员一下再采血比较好。