PBMC没有分离出来

momoenn

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今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个核细胞。大侠们遇到过这种情况吗？在线等待。

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39
. Z3 _$ @8 t+ l+ j* s# w( _今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

4 ]: ?: s* J9 i. @8 s能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！
" [$ Y6 V% Z7 v& u" P5 O
1 E6 R$ I- }) c" z: P0 \4 |首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：
% `( m2 `. A* G6 S0 i% x  D& h- z" Q% P+ o' B
一、        溶液配制
8 S! X# S+ L4 p* @* X: p1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。
. |# t) X+ L5 {$ e$ `( f2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释
: k: w% _+ I+ D% I3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液5 f5 L& A7 h: u3 ]( O) q$ i
4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。4 C* k) B" G$ W7 S2 ^
6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。6 k% t: M9 a- Y' K- ?# K
7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。# b1 T% a  M' m
8、        6~8周龄雌鼠
& W9 H$ o/ V' V+ P9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes
# i7 a) ^2 A, t10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA
0 }9 l& i3 Z8 T& C二 . 小鼠淋巴细胞的获取：# S3 C4 q1 r1 y* A$ }
1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。
: K( B) ?5 K' k8 u0 b' z2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。) U( D$ h: l) r& s) z
3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。* m2 {; J5 x' }8 C% i# I" b
4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。! m5 H5 l: q5 }8 W. G
5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。* v& V; N) ~, R, I7 R
6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。
" Y; i' ~* q4 ?& o. x7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。6 s: j: }2 V+ _% S
8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。( a* o! a4 z- X: |# D4 J
9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。$ I4 H5 I# ~2 [9 |6 G
10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。8 U4 A( O& r2 l- |7 m( a
11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。
" q; U& `7 K5 d0 Y- }: Y12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。
: o9 F* f7 \3 _7 \1 i6 X2 m13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。+ n/ m) E0 X# E* P% |
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! y# I9 l) Q/ X5 }

thor0504

回复 momoenn 的帖子+ a. y$ j1 h, |# }+ H
1 T- n$ \1 f- k& {
取血量是多少？按照什么程序操作的？用的什么方法分离的？密度梯度还是别的？

momoenn

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7 w/ [+ s7 Q& h. Q; \  y: L: G我们用的是ficoll

momoenn

回复 thor0504 的帖子8 w/ V' y2 ]- U; @; {( X

5 N! ?- B/ [! t, `1 f2 |100ml，沉降加密度梯度离心

thor0504

回复 momoenn 的帖子2 H2 m3 W. g  B/ J8 Y& }7 S5 J
6 B2 j9 \" m- Q0 S
具体的步骤呢？每步的离心力、时间、ficoll的用量分别是多少？有先分离血浆吗？

heirrii

100ml外周血，应该能分很多啊

heirrii

血液先稀释没

levell

血液细胞用PBS稀释后加入到淋巴细胞分离液上，离心，注意离心加速度调到最低，很关键，不然起步和停止速度过快就会把液面打散了0 V3 Y- P/ |5 G- H

weijunning

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# M2 a: ?. x% t6 m& K/ ?, e7 O( z/ o8 A
请问这个病人是什么病人？如果是癌症患者，无动员直接从上肢静脉抽血，很难获得足够数量的PBMC，有的血象差的病人基本上分离不到白膜层。所以，建议还是先动员一下再采血比较好。