PBMC没有分离出来

momoenn

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今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个核细胞。大侠们遇到过这种情况吗？在线等待。

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39 0 \( n; j! M+ {" B) ?: M( y
今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

3 Y+ R" u( A+ v能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！# P+ f% a' v; O9 V0 p9 r
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首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：
3 i, z" _, T+ R* D6 h3 `3 g
2 m! Z7 }# B1 W- D+ y; a- a一、        溶液配制
' |$ B2 A9 o# s4 m' g) L2 A3 N& {; }1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。6 G  w6 R1 I: C" o8 d4 X# T6 h: H
2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释& ?, g: }5 G$ N' q% X
3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液: w* M; {" \/ W% }- q
4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。* z$ F3 t6 b, E$ P% O/ _' n2 \+ c3 |
6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。
( [' G) V# f; b% j) @) A/ X7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。
7 W; K" F+ i& P3 }8、        6~8周龄雌鼠. }. r) `4 T7 s4 x6 E" K& z
9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes
: g3 _# y  X# w' R" n' A10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA, C0 M" _. T2 x) s( V; I% ~
二 . 小鼠淋巴细胞的获取：% `1 [9 U3 {. x7 B: U$ N* o- n
1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。: b& f' y2 X8 a6 K7 Z1 q: T
2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。  M8 V& L7 L/ E# r6 L
3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。" H- J; o5 ^7 H3 c% z& H4 m
4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。- Z: r1 b: w0 |( _1 F
5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。
0 G7 X! h3 n- z1 p6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。
' U6 t' k" `7 l$ r7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。8 i+ w& V/ Z: T: o" F8 S( l
8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。9 M2 R8 U  i  ]$ H
9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。
* M5 \$ w# M$ c1 a0 a10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。
' x; K5 F9 Z2 _# Y11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。( `+ C$ V9 U* N0 }; j
12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。) \  ]+ w8 D9 a3 p. \
13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。" E  {. O, v" l0 Q% e% V, `7 P
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thor0504

回复 momoenn 的帖子7 D& E4 |% D! s' |8 Y& {; J9 X6 Q
8 f! s3 Y. B' h) R- t4 O! N$ U1 N' w: O
取血量是多少？按照什么程序操作的？用的什么方法分离的？密度梯度还是别的？

momoenn

回复 Andyhigh 的帖子' `0 t8 ?  e' K0 V- K

- |- X% m9 A. O5 b1 ?& p4 Z7 B我们用的是ficoll

momoenn

回复 thor0504 的帖子  n' a/ H6 H* Q: X, C

) J; q  }4 r9 |; g4 ^100ml，沉降加密度梯度离心

thor0504

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- z0 i' T9 w* u9 ?9 P4 e3 k9 ]' N1 ^& R, {
具体的步骤呢？每步的离心力、时间、ficoll的用量分别是多少？有先分离血浆吗？

heirrii

100ml外周血，应该能分很多啊

heirrii

血液先稀释没

levell

血液细胞用PBS稀释后加入到淋巴细胞分离液上，离心，注意离心加速度调到最低，很关键，不然起步和停止速度过快就会把液面打散了& }5 f: b2 q) Y

weijunning

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9 j/ r- Q6 O3 q' I7 j; O# @6 p请问这个病人是什么病人？如果是癌症患者，无动员直接从上肢静脉抽血，很难获得足够数量的PBMC，有的血象差的病人基本上分离不到白膜层。所以，建议还是先动员一下再采血比较好。