western 疑问

huangcong1988

最近做western，蛋白分子量大小为，40_55kda,我电泳时间为120min，100V，转膜为100mA，100min，一抗跟二抗稀释均为1：:2000（稀释比例都不算高），结果照胶完全没带，连内参也没有带，这是为什么呢？求大神指点，谢谢了先！

ciweiyuan

你干转还是湿转？
* S! I) ^% ?4 C

青云之上

, X& N) p5 A. L

+ g$ j8 w+ V4 z转移效率如何？建议：0 _0 t3 V$ z! g; A" k
1、跑完电泳可以用考马染胶看看你提的蛋白没有问题；
. m+ x" {4 u7 J) [( J/ D7 N2、转完摸后 用立春红染色 看下蛋白是否从胶上成功转到摸上了；
7 q9 B3 S- a) V& l  V  R" ~7 W: j3、摸一下一抗 二抗的浓度， 即从大浓度开始做，尽管会出现非特异性条带，
2 {  l3 ~  V+ P, s/ @: `$ \8 A5 N/ v      最起码条带出来了，然后再已不同的抗体稀释比做，背景深了 可以加大' p$ F. B8 L9 l, g0 e6 ]- z8 \8 p
      封闭液的浓度和时间。

huangcong1988

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- ]8 x2 o% `0 d$ R4 F1 K湿转

huangcong1988

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! P# t5 v4 [) r% s* O
" T2 _$ J7 ~/ e  |跑完电泳怎么看提的蛋白没问题？考染之后胶还能转膜？考染后怎么看能看出蛋白样品没有降解呢？

huangcong1988

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2 B+ W. R8 |) H6 {2 j, ?; X0 d2 y3 w还有，我转膜以后marker都转上了，就不知道条带是不是也一样转上了

ccwei0615

If you would like to confirm the efficiency of transfer, you could stain the gel with commassive blue to make sure most of proteins are transferred.

ccwei0615

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2 `1 \; {% u# X! _- c8 }" w# C  W; r0 J8 L' T9 A2 s
Once your protein gel is stained with commassie blue, it won't work again in your following immunoblotting. If your can't see clear individual protein bands in stead of a huge smear, that means your proteins are degraded.

maiweiqian

转膜没转好？抗体有问题？

sc-cxw

湿转可以恒流也可以恒压，我们通常是一张膜60-80mA，两种膜120-160mA.时间为50-60min。你转100min会不会有点过呀？