western 疑问

huangcong1988

最近做western，蛋白分子量大小为，40_55kda,我电泳时间为120min，100V，转膜为100mA，100min，一抗跟二抗稀释均为1：:2000（稀释比例都不算高），结果照胶完全没带，连内参也没有带，这是为什么呢？求大神指点，谢谢了先！

ciweiyuan

你干转还是湿转？) t. s( J2 \0 A1 ~" ], A

青云之上

: y2 v9 d4 ^. Q, `
8 Z  r* b0 ~( A8 z+ r/ O) u转移效率如何？建议：- z" F# ]  o+ u' e( S; M  m
1、跑完电泳可以用考马染胶看看你提的蛋白没有问题；0 f+ L7 u" Y- u' ^4 @( R! o% V
2、转完摸后 用立春红染色 看下蛋白是否从胶上成功转到摸上了；
! W3 H; g0 I9 {3 D3、摸一下一抗 二抗的浓度， 即从大浓度开始做，尽管会出现非特异性条带，$ {0 d+ b- F* B) \8 }& o
      最起码条带出来了，然后再已不同的抗体稀释比做，背景深了 可以加大
& [! k0 K3 p/ O' k* h% n! o      封闭液的浓度和时间。

huangcong1988

回复 ciweiyuan 的帖子0 O' ~, F8 c! @) I; g+ L9 w2 |
3 n5 J0 ~1 K. ?! l: C
湿转

huangcong1988

回复 青云之上 的帖子# Q8 g! C! D* B: Y/ f
5 U0 N$ p9 }6 a$ S
跑完电泳怎么看提的蛋白没问题？考染之后胶还能转膜？考染后怎么看能看出蛋白样品没有降解呢？

huangcong1988

回复 青云之上 的帖子
2 y* {' y) X3 e/ v9 z' P5 x
& V0 X  f& p9 P  Q3 }" d# m$ D. T还有，我转膜以后marker都转上了，就不知道条带是不是也一样转上了

ccwei0615

If you would like to confirm the efficiency of transfer, you could stain the gel with commassive blue to make sure most of proteins are transferred.

ccwei0615

回复 huangcong1988 的帖子9 e. ~8 {) g+ O7 j
7 K( Q, G8 g8 T9 }% b
Once your protein gel is stained with commassie blue, it won't work again in your following immunoblotting. If your can't see clear individual protein bands in stead of a huge smear, that means your proteins are degraded.

maiweiqian

转膜没转好？抗体有问题？

sc-cxw

湿转可以恒流也可以恒压，我们通常是一张膜60-80mA，两种膜120-160mA.时间为50-60min。你转100min会不会有点过呀？