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western 疑问 [复制链接]

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楼主
发表于 2014-5-7 11:11 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
最近做western,蛋白分子量大小为,40_55kda,我电泳时间为120min,100V,转膜为100mA,100min,一抗跟二抗稀释均为1::2000(稀释比例都不算高),结果照胶完全没带,连内参也没有带,这是为什么呢?求大神指点,谢谢了先!
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沙发
发表于 2014-5-7 13:34 |只看该作者
你干转还是湿转?
4 z$ {4 A2 i- Y% i
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藤椅
发表于 2014-5-7 15:35 |只看该作者
本帖最后由 青云之上 于 2014-5-7 15:36 编辑 / y; ]9 f. w/ l/ G. f9 k* N

/ L/ {9 x4 k" T3 @" C# P转移效率如何?建议:4 E7 B0 W3 W' y
1、跑完电泳可以用考马染胶看看你提的蛋白没有问题;7 A9 y) z1 v! M8 P( J
2、转完摸后 用立春红染色 看下蛋白是否从胶上成功转到摸上了;5 H6 l7 c1 q+ U; W2 s" @! g0 L
3、摸一下一抗 二抗的浓度, 即从大浓度开始做,尽管会出现非特异性条带,2 Y4 h/ V! L4 `9 E6 o
      最起码条带出来了,然后再已不同的抗体稀释比做,背景深了 可以加大/ m% U2 D6 B5 h+ |3 x
      封闭液的浓度和时间。
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板凳
发表于 2014-5-7 16:55 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
回复 ciweiyuan 的帖子% ^- F) F' I. I* ~+ S1 \: \

7 l# ^& @- z0 E7 s) r, b6 i+ ~. P$ ~湿转

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报纸
发表于 2014-5-7 16:56 |只看该作者
回复 青云之上 的帖子
# x, ^2 ~  L; O4 c, d. B- F
7 r* `1 l% \1 \: T  Q1 m跑完电泳怎么看提的蛋白没问题?考染之后胶还能转膜?考染后怎么看能看出蛋白样品没有降解呢?
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地板
发表于 2014-5-7 16:57 |只看该作者
回复 青云之上 的帖子# d9 {4 q( l/ A' H2 L3 U

3 E% B0 [8 S, F: h: r* y! H还有,我转膜以后marker都转上了,就不知道条带是不是也一样转上了

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发表于 2014-5-7 18:53 |只看该作者
If you would like to confirm the efficiency of transfer, you could stain the gel with commassive blue to make sure most of proteins are transferred.
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发表于 2014-5-7 18:56 |只看该作者
回复 huangcong1988 的帖子. G8 r* N4 e% _$ W

6 b$ V9 x3 V! M4 TOnce your protein gel is stained with commassie blue, it won't work again in your following immunoblotting. If your can't see clear individual protein bands in stead of a huge smear, that means your proteins are degraded.
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发表于 2014-5-8 23:33 |只看该作者
转膜没转好?抗体有问题?
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发表于 2014-5-15 14:26 |只看该作者
湿转可以恒流也可以恒压,我们通常是一张膜60-80mA,两种膜120-160mA.时间为50-60min。你转100min会不会有点过呀?
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