求助：MSC成骨成脂分化染色问题

龟酱

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成骨成脂都用的Gibco试剂，但都并不成功，想请教下大家问题出现在哪里。。% I# {& S: K& I0 y5 `7 Q
用的细胞是P3代冻存复苏后的MSC，细胞密度到80%时换诱导培养基
( t6 a# P+ d) ?! L" m: t# Z成脂：
; k; {: r) x6 P成脂诱导12天出现少量分散的单个圆形透明颗粒，细胞已经开始老化死亡迹象
0 l# l9 B6 \7 s+ l/ T( F% Q. u染色用的是油红O。。配的是2g/100mL油红O 60%异丙醇（分析纯）40%水，配好后过滤" K5 @4 b' T' {- h. r* y
染色步骤：
% x0 i4 K$ r+ m 1. 弃去培养基，用PBS清洗6 b5 B- w# ^% N2 {4 ~/ `
2. 4%多聚甲醛固定30min. C; u  G+ u( Q0 U
3. 弃去多聚甲醛，油红O染色10分钟, X/ s3 v& v) ^' n8 J) ~" ]
4. 弃去油红O，异丙醇(分析纯)清洗5次! Z: ^5 @. y1 O% h
5. 加0.5mL异丙醇观察（24孔板）
& s* j! N$ k0 p' |4 q9 N文献中说用异丙醇清洗2-3次，但每次加入异丙醇后都会飘起许多黑红的片状碎片。。。洗至少5次才能弃去碎片，，可显微镜观察后完全没有染上色。。
' {; b- w7 W( y5 x不知道问题出现在哪呢？很急。。。
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- T# g7 S) }# b% [成骨：
6 F7 I6 x) ?& E3 N) e/ `0 t/ `6 C) f, h  e7 R
诱导12天后细胞也出现死亡趋势，而且显微镜观察细胞密集区有很多黑色的颗粒，不知道是凋亡细胞还是钙结节
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茜素红是用0.5g茜素红粉末和50mL水配的，然后过滤+ G$ _. }" w3 V" o7 h& {
染色步骤：( L6 D) N, R1 c; H6 J! v
1. 弃去培养基，用PBS清洗1 `# J: `8 A7 ^* g
2. 4%多聚甲醛固定30min) Z( x$ H$ p9 N% [/ X
3. 弃去多聚甲醛，茜素红染色3分钟0 W2 f% n' @7 R0 n
4. PBS清洗2次
3 k- f. g/ L, B: a: T 5. 加0.5mLPBS观察（24孔板）0 b# g+ W% Q$ H1 N. P3 C

. I$ k2 w* n' U6 S: y4 ?3 l显微镜下观察得染色前出现的黑色颗粒变成红色，但是是透光的圆形和椭圆形。。。感觉会不会并不是钙结节？  p4 Q' c( V7 @4 g& E- A+ `/ \
5 j$ c8 ~; w% C$ H' O1 x
向各位前辈赐教。。。# y8 R% e, Z4 _, X* A5 _, R( L" P% g4 a
另外如果大家有诱导成功的照片希望能在这里分享一下，谢谢

leaderhou

我做的成骨和成脂染色都挺好的呀
% N, @( r% ^3 t+ C& t4 W9 k成脂染色时候4%多聚甲醛固定15min，去除多聚甲醛后最好用异丙醇浸润2次，稍微晾干。油红染色后异丙醇我们没有清洗那么多次，直接用三蒸水或者PBS（延缓脂肪滴破裂）观察照相1 P! x0 f) K9 V; ]7 v
成骨染色0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，5min-10min
0 ]: E& g& y  [! ^5 p' f8 Y& F祝实验顺利

light_blue

以下建议：5 t: Z# n1 h9 ?5 D; m
1.成脂诱导在异丙醇加入之前就能看到是否有脂滴着色，很明显。
) y; M* ?* u% ?+ K2.成骨诱导如果用双蒸水配置茜素红需要调ph4.1~4.3。

yaolutian

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您好，请问调ph是用氨水吗，还是NaOH就行