求助：MSC成骨成脂分化染色问题

龟酱

: k& w" N! u9 r' h; q
+ T9 d/ ^/ Q) _6 b! U" d7 O成骨成脂都用的Gibco试剂，但都并不成功，想请教下大家问题出现在哪里。。
: E, ?3 u: w* O$ u5 a用的细胞是P3代冻存复苏后的MSC，细胞密度到80%时换诱导培养基4 b& ]* c" T: x  B4 q$ h! t1 l3 Z
成脂：6 h6 p5 X5 O: f- g$ z# c3 j/ g" v
成脂诱导12天出现少量分散的单个圆形透明颗粒，细胞已经开始老化死亡迹象
) I, m# t2 g% N# j7 ]; s染色用的是油红O。。配的是2g/100mL油红O 60%异丙醇（分析纯）40%水，配好后过滤! H( ]3 ^9 S" O, \1 J6 y: }' A
染色步骤：
; x& w' Y* l+ B% l  v 1. 弃去培养基，用PBS清洗3 x# @6 n- m8 k* z
2. 4%多聚甲醛固定30min
9 ~8 k: U: c2 }% d4 ~ 3. 弃去多聚甲醛，油红O染色10分钟+ M/ I( S8 {: c% v- h
4. 弃去油红O，异丙醇(分析纯)清洗5次
  l) g- }& l, \$ q) u: k! K) f+ H 5. 加0.5mL异丙醇观察（24孔板） 9 f& @' c0 b  u: g% d) j( E
文献中说用异丙醇清洗2-3次，但每次加入异丙醇后都会飘起许多黑红的片状碎片。。。洗至少5次才能弃去碎片，，可显微镜观察后完全没有染上色。。
7 b0 W$ o( K5 V# \" \' D不知道问题出现在哪呢？很急。。。
  N) |! T. q3 z! C& z) J% I/ z
- s7 s1 V! }6 E) V4 V# p& x+ l4 Z* ]" a
成骨：! V1 ^4 k3 z- F
0 A/ G8 d2 p' f8 L1 ]
诱导12天后细胞也出现死亡趋势，而且显微镜观察细胞密集区有很多黑色的颗粒，不知道是凋亡细胞还是钙结节
/ n% C. q! c8 X. g: V. L& I% B6 z$ S: ?4 y
茜素红是用0.5g茜素红粉末和50mL水配的，然后过滤
. N! _( }* I4 W$ v6 t, `' P" c* ]染色步骤：  t5 j6 j& z" K( X2 @. U
1. 弃去培养基，用PBS清洗- |1 K- ?1 H6 r& A7 F
2. 4%多聚甲醛固定30min
3 z+ @- p& D) `6 s* u( [6 K. G 3. 弃去多聚甲醛，茜素红染色3分钟) c. I; M" A( g
4. PBS清洗2次
% s# s7 O/ P1 o 5. 加0.5mLPBS观察（24孔板）: ~& N3 L+ c/ @+ d- ]9 R

" A. ~7 E: z. c8 ^5 J显微镜下观察得染色前出现的黑色颗粒变成红色，但是是透光的圆形和椭圆形。。。感觉会不会并不是钙结节？0 X' r; o1 O4 u& c; X! {' I
! f3 `+ b. W9 Y* n1 h4 K
向各位前辈赐教。。。
, u+ x& {- B4 O5 w另外如果大家有诱导成功的照片希望能在这里分享一下，谢谢

leaderhou

我做的成骨和成脂染色都挺好的呀( m& _/ ^! H% i) \) _* }
成脂染色时候4%多聚甲醛固定15min，去除多聚甲醛后最好用异丙醇浸润2次，稍微晾干。油红染色后异丙醇我们没有清洗那么多次，直接用三蒸水或者PBS（延缓脂肪滴破裂）观察照相
+ }9 B2 r+ B4 ^: Z; e; [成骨染色0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，5min-10min
+ z% a( a6 A- h  `祝实验顺利

light_blue

以下建议：
8 n: y/ E2 V: k/ G- a, E3 `1.成脂诱导在异丙醇加入之前就能看到是否有脂滴着色，很明显。
- o, s" ]9 d6 t4 s' R2 k5 S# L9 x2.成骨诱导如果用双蒸水配置茜素红需要调ph4.1~4.3。

yaolutian

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& ?* Z: r% Z- F0 f( u
5 v& P+ y$ E' B您好，请问调ph是用氨水吗，还是NaOH就行