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求助:MSC成骨成脂分化染色问题 [复制链接]

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楼主
发表于 2014-5-19 23:46 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 龟酱 于 2014-5-19 23:53 编辑
( i$ V( Y; o7 A. c$ C3 L" [
; D4 ~0 L* N5 H$ y  F: z1 S7 |成骨成脂都用的Gibco试剂,但都并不成功,想请教下大家问题出现在哪里。。
8 Z$ w' T3 \3 ?7 e  Y) i3 [用的细胞是P3代冻存复苏后的MSC,细胞密度到80%时换诱导培养基
2 @1 F, T2 t1 g" g% [% A4 M成脂:
9 D/ q& a3 ^7 [" C" d成脂诱导12天出现少量分散的单个圆形透明颗粒,细胞已经开始老化死亡迹象
" w$ E$ @! q9 d' \& h4 Z% [: U染色用的是油红O。。配的是2g/100mL油红O 60%异丙醇(分析纯)40%水,配好后过滤
* b7 A% r8 r: _' d) W染色步骤:1 F2 e% f. e- \+ N4 i6 Y# c) c: S
1. 弃去培养基,用PBS清洗# p# x/ }/ a8 L0 R8 e: z% O
2. 4%多聚甲醛固定30min) W) M5 v0 ?' P8 l3 G/ ]. c$ F
3. 弃去多聚甲醛,油红O染色10分钟; b) \% G5 I6 i! N+ J
4. 弃去油红O,异丙醇(分析纯)清洗5次
& o( A& e" ?" r7 ?3 A 5. 加0.5mL异丙醇观察(24孔板)
9 i; r) d4 q! F% W文献中说用异丙醇清洗2-3次,但每次加入异丙醇后都会飘起许多黑红的片状碎片。。。洗至少5次才能弃去碎片,,可显微镜观察后完全没有染上色。。
7 n2 L- r8 T% C5 j% P不知道问题出现在哪呢?很急。。。" X- x8 g+ Q& I  ?+ R% y4 c
4 _8 f! y* d6 \% Y. D2 @

; u; l8 p; r# }5 m1 q* F8 b成骨:
" i. \) [7 D) j6 J2 `0 @+ T/ m1 r+ [. O% L9 h3 [* Z: |. Y: }
诱导12天后细胞也出现死亡趋势,而且显微镜观察细胞密集区有很多黑色的颗粒,不知道是凋亡细胞还是钙结节
4 [; O- i( a1 _' `- W0 ~# E; t
+ ^4 M3 A4 {0 P茜素红是用0.5g茜素红粉末和50mL水配的,然后过滤7 C$ j+ P' j/ A4 E. H  q; M; g2 l
染色步骤:
* B: j# ]7 z% `) L9 s' I 1. 弃去培养基,用PBS清洗
  I/ s; }' L! Y, h. [0 n 2. 4%多聚甲醛固定30min
/ Q# u7 s  l5 B- r 3. 弃去多聚甲醛,茜素红染色3分钟
; f  U3 m! [% Q6 m 4. PBS清洗2次
; S, R8 K& }9 e 5. 加0.5mLPBS观察(24孔板)! v. F, S8 r' i9 M  B

  r: p; ^9 A" T3 ~显微镜下观察得染色前出现的黑色颗粒变成红色,但是是透光的圆形和椭圆形。。。感觉会不会并不是钙结节?
$ A, g4 a% B$ N' E; \/ K
8 V6 u$ a! P1 T* D) E向各位前辈赐教。。。
( D9 t" a8 z4 ?# L* ^4 V' D' O另外如果大家有诱导成功的照片希望能在这里分享一下,谢谢
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沙发
发表于 2014-5-26 16:21 |只看该作者
我做的成骨和成脂染色都挺好的呀
. ?. l" T/ V( A6 B. V; {+ W% \成脂染色时候4%多聚甲醛固定15min,去除多聚甲醛后最好用异丙醇浸润2次,稍微晾干。油红染色后异丙醇我们没有清洗那么多次,直接用三蒸水或者PBS(延缓脂肪滴破裂)观察照相
) x9 A5 p6 w* N1 l( L) `" C成骨染色0.1%茜素红-Tris-Hcl(PH 8.3)37℃,5min-10min
: H- Q1 F+ ?1 ]/ z# b祝实验顺利
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藤椅
发表于 2014-5-26 22:16 |只看该作者
以下建议:
. q: r/ B$ Q" a2 m. b1 V1.成脂诱导在异丙醇加入之前就能看到是否有脂滴着色,很明显。- x1 h8 c4 }5 ^5 W' F
2.成骨诱导如果用双蒸水配置茜素红需要调ph4.1~4.3。
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板凳
发表于 2018-9-19 02:52 |只看该作者
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回复 light_blue 的帖子, ?9 w% f6 G/ _+ M8 f5 ~
; C8 N8 t/ j$ D$ G  m( B
您好,请问调ph是用氨水吗,还是NaOH就行
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