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本帖最后由 龟酱 于 2014-5-19 23:53 编辑 1 y6 j1 q7 q$ O$ ?& {. K, @. s
6 W2 o& l# d7 d1 a1 W; ~
成骨成脂都用的Gibco试剂，但都并不成功，想请教下大家问题出现在哪里。。
1 T" m. ^4 M! R用的细胞是P3代冻存复苏后的MSC，细胞密度到80%时换诱导培养基
7 G4 \0 c; v2 y1 }6 P6 a成脂：; }" a4 x8 H. P* u$ x
成脂诱导12天出现少量分散的单个圆形透明颗粒，细胞已经开始老化死亡迹象/ \: h9 {( `; j& k$ G1 u
染色用的是油红O。。配的是2g/100mL油红O 60%异丙醇（分析纯）40%水，配好后过滤. J. w+ E R6 O2 p
染色步骤：
+ y* v6 [& j8 A9 b. B9 W% } 1. 弃去培养基，用PBS清洗6 W# p4 W, V6 p6 I/ w; [. j0 Q
2. 4%多聚甲醛固定30min1 M' V8 b. v5 M6 j0 V& ]( H
3. 弃去多聚甲醛，油红O染色10分钟0 l p3 Y" x _5 C2 X
4. 弃去油红O，异丙醇(分析纯)清洗5次
9 `; B1 m6 Y2 @+ R) l3 t* b 5. 加0.5mL异丙醇观察（24孔板）
P) F( v4 l: M" m文献中说用异丙醇清洗2-3次，但每次加入异丙醇后都会飘起许多黑红的片状碎片。。。洗至少5次才能弃去碎片，，可显微镜观察后完全没有染上色。。' ~( C* `6 A1 _3 T% E
不知道问题出现在哪呢？很急。。。
+ J5 J& L( Y) s( S# L
/ r" w: i: L' C* R' O3 k* k0 |3 X+ F. n% H1 m- I& {0 ]" {2 r
成骨：; c, F' v# O4 _, V( Z- j, h
3 s6 a' A' V% ~: M5 r, I ^8 s诱导12天后细胞也出现死亡趋势，而且显微镜观察细胞密集区有很多黑色的颗粒，不知道是凋亡细胞还是钙结节$ j# t+ `4 z0 t+ p2 I+ P. F- s
8 j2 O9 H l: A3 f
茜素红是用0.5g茜素红粉末和50mL水配的，然后过滤) [1 Y/ P6 N. V5 I, t1 h
染色步骤：
& w$ o, t D$ a 1. 弃去培养基，用PBS清洗8 H% \# H/ b: ^4 J y& J
2. 4%多聚甲醛固定30min
2 @. X% a0 h6 r6 ]7 | 3. 弃去多聚甲醛，茜素红染色3分钟
( {9 E- U" w) S- H0 T6 d 4. PBS清洗2次8 Q5 ?4 O7 C. x7 ]% Z9 _; w
5. 加0.5mLPBS观察（24孔板）
1 T5 N( |# H6 s: g" m4 M
2 N( ^& `% M! N$ U3 I显微镜下观察得染色前出现的黑色颗粒变成红色，但是是透光的圆形和椭圆形。。。感觉会不会并不是钙结节？- D& H6 ^" E4 s& @' m4 V
# v, Z+ p _8 V3 y: i向各位前辈赐教。。。
4 E1 u# u7 W% x9 j4 |+ k% h另外如果大家有诱导成功的照片希望能在这里分享一下，谢谢 |
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发表于 2014-5-19 23:46
发表于 2014-5-26 16:21
