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本帖最后由 龟酱 于 2014-5-19 23:53 编辑 ( _: X- f4 V+ m, c( p' d
0 [; m$ A' J6 C7 \- w h成骨成脂都用的Gibco试剂，但都并不成功，想请教下大家问题出现在哪里。。
9 r# v8 J( w9 t+ f1 h! H5 m用的细胞是P3代冻存复苏后的MSC，细胞密度到80%时换诱导培养基
3 \" ] {* d" n2 P: J3 T成脂：5 a; Q) E+ R ?7 D; p
成脂诱导12天出现少量分散的单个圆形透明颗粒，细胞已经开始老化死亡迹象. {/ A0 }0 g8 G0 T/ i# d7 J
染色用的是油红O。。配的是2g/100mL油红O 60%异丙醇（分析纯）40%水，配好后过滤4 y" ~7 y/ |3 Q7 k! W
染色步骤：: Q+ X: }, ?+ s" R+ O
1. 弃去培养基，用PBS清洗4 N0 {- L/ W) y1 j6 y5 S. w
2. 4%多聚甲醛固定30min
, y0 K2 d& O( r) ]/ _8 L U- X 3. 弃去多聚甲醛，油红O染色10分钟
5 X z& Q3 j3 `' a! y, z. o0 v5 U 4. 弃去油红O，异丙醇(分析纯)清洗5次
3 z6 H3 O& I( R. J 5. 加0.5mL异丙醇观察（24孔板）
! ]: Z8 _$ W( {8 D5 \文献中说用异丙醇清洗2-3次，但每次加入异丙醇后都会飘起许多黑红的片状碎片。。。洗至少5次才能弃去碎片，，可显微镜观察后完全没有染上色。。
$ G% ^4 \4 K1 o& n不知道问题出现在哪呢？很急。。。
" P7 w* g4 b( l4 R. M! r! A0 D* ^/ ~
) K0 K9 ~, I3 s/ D% s- E8 k$ @成骨：+ f, v7 I' {6 X
$ G- ^( j' I: f! _- d
诱导12天后细胞也出现死亡趋势，而且显微镜观察细胞密集区有很多黑色的颗粒，不知道是凋亡细胞还是钙结节7 x9 I4 ]7 ~9 P
1 G; I. ^' z# c4 ~ X茜素红是用0.5g茜素红粉末和50mL水配的，然后过滤
6 C \: B- U6 E$ Z染色步骤：, G6 ~( B; }0 h$ x8 F" @6 @/ r
1. 弃去培养基，用PBS清洗
; v+ l* L0 Z' t, g7 H 2. 4%多聚甲醛固定30min8 S3 ? K8 }2 U
3. 弃去多聚甲醛，茜素红染色3分钟
( u5 t* w# }: V 4. PBS清洗2次7 o2 i+ }! X/ `! d7 t
5. 加0.5mLPBS观察（24孔板）
1 `" S- `' W" K) ?% h) J
+ e2 ^4 g3 e/ |& y0 }6 p显微镜下观察得染色前出现的黑色颗粒变成红色，但是是透光的圆形和椭圆形。。。感觉会不会并不是钙结节？9 Z- _7 z1 @) L$ P1 U/ Q4 C
1 @6 Y' o7 e& {3 D/ l向各位前辈赐教。。。5 H; a# A- Q' m3 D' g0 |
另外如果大家有诱导成功的照片希望能在这里分享一下，谢谢 |
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发表于 2014-5-19 23:46
发表于 2014-5-26 16:21
