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本帖最后由 龟酱 于 2014-5-19 23:53 编辑
( i$ V( Y; o7 A. c$ C3 L" [
; D4 ~0 L* N5 H$ y F: z1 S7 |成骨成脂都用的Gibco试剂，但都并不成功，想请教下大家问题出现在哪里。。
8 Z$ w' T3 \3 ?7 e Y) i3 [用的细胞是P3代冻存复苏后的MSC，细胞密度到80%时换诱导培养基
2 @1 F, T2 t1 g" g% [% A4 M成脂：
9 D/ q& a3 ^7 [" C" d成脂诱导12天出现少量分散的单个圆形透明颗粒，细胞已经开始老化死亡迹象
" w$ E$ @! q9 d' \& h4 Z% [: U染色用的是油红O。。配的是2g/100mL油红O 60%异丙醇（分析纯）40%水，配好后过滤
* b7 A% r8 r: _' d) W染色步骤：1 F2 e% f. e- \+ N4 i6 Y# c) c: S
1. 弃去培养基，用PBS清洗# p# x/ }/ a8 L0 R8 e: z% O
2. 4%多聚甲醛固定30min) W) M5 v0 ?' P8 l3 G/ ]. c$ F
3. 弃去多聚甲醛，油红O染色10分钟; b) \% G5 I6 i! N+ J
4. 弃去油红O，异丙醇(分析纯)清洗5次
& o( A& e" ?" r7 ?3 A 5. 加0.5mL异丙醇观察（24孔板）
9 i; r) d4 q! F% W文献中说用异丙醇清洗2-3次，但每次加入异丙醇后都会飘起许多黑红的片状碎片。。。洗至少5次才能弃去碎片，，可显微镜观察后完全没有染上色。。
7 n2 L- r8 T% C5 j% P不知道问题出现在哪呢？很急。。。" X- x8 g+ Q& I ?+ R% y4 c
4 _8 f! y* d6 \% Y. D2 @
; u; l8 p; r# }5 m1 q* F8 b成骨：
" i. \) [7 D) j6 J2 `0 @+ T/ m1 r+ [. O% L9 h3 [* Z: |. Y: }
诱导12天后细胞也出现死亡趋势，而且显微镜观察细胞密集区有很多黑色的颗粒，不知道是凋亡细胞还是钙结节
4 [; O- i( a1 _' `- W0 ~# E; t
+ ^4 M3 A4 {0 P茜素红是用0.5g茜素红粉末和50mL水配的，然后过滤7 C$ j+ P' j/ A4 E. H q; M; g2 l
染色步骤：
* B: j# ]7 z% `) L9 s' I 1. 弃去培养基，用PBS清洗
I/ s; }' L! Y, h. [0 n 2. 4%多聚甲醛固定30min
/ Q# u7 s l5 B- r 3. 弃去多聚甲醛，茜素红染色3分钟
; f U3 m! [% Q6 m 4. PBS清洗2次
; S, R8 K& }9 e 5. 加0.5mLPBS观察（24孔板）! v. F, S8 r' i9 M B
r: p; ^9 A" T3 ~显微镜下观察得染色前出现的黑色颗粒变成红色，但是是透光的圆形和椭圆形。。。感觉会不会并不是钙结节？
$ A, g4 a% B$ N' E; \/ K
8 V6 u$ a! P1 T* D) E向各位前辈赐教。。。
( D9 t" a8 z4 ?# L* ^4 V' D' O另外如果大家有诱导成功的照片希望能在这里分享一下，谢谢 |
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发表于 2014-5-19 23:46
发表于 2014-5-26 16:21
