求助-小鼠颗粒细胞体外培养

moluxingke

最近在做小鼠颗粒细胞的体外培养，查了一些方法：' G8 H; @  C+ b2 {% ]0 E# E8 V% D# ?
PMSG处理21-22天的小鼠，然后大约46-48h后取卵巢。( x9 P* ?+ U# V9 K+ g& o
刺破卵巢中较大的卵泡，使COC释放出来，然后用移液器反复吹吸，使颗粒细胞和卵母细胞分离，移走卵母细胞，将颗粒细胞离心收集。6 ~7 h3 Q. ?2 l- N* |% L; K
然后PBS洗涤一下，继续离心。$ p9 k" c6 K2 q1 J4 H+ q+ {. h* v
DMEM/F12培养基重悬，培养。
1 P* ]3 R! S+ a4 B然后我想问一下：1  这种方法收集的大多是围绕卵母细胞的卵丘颗粒细胞，壁层颗粒细胞比较少，而且刺破卵泡过程中，有较多的颗粒细胞损失掉了，怎么才能收集较多的颗粒细胞，如果要铺一个12孔板的话，至少需要多少只小鼠？3 \* E1 M' s) f- b0 G: E
    2 因为小鼠已经经过PMSG处理了，也就是说颗粒细胞已经对PMSG产生应答一次了，那么在体外实验中如果我还打算用FSH处理这些颗粒细胞，颗粒细胞对FSH的响应会不会有一定程度的减弱？' e, C+ e. E- [2 \7 g  k5 r( w6 N
3  原代分离培养过程中要不要加双抗？' ^# d7 r3 o# ?" J( J/ S7 _

dxb1985

Murine granulosa cell morphology and function are regulated by a synthetic Arg–Gly–Asp matrix
. ]+ \' F3 `7 t1 C, `' f: y* V: E不知道这篇文章对你是否有帮助，用针多扎几次，颗粒细胞就出来了

moluxingke

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6 x( K* q+ H" p1 y, L$ ~+ ]
- K0 `8 `: @0 T7 s( T. h谢谢帮助，多扎几次得到的COC会多一些，我现在很想知道扎卵泡过 程中散落到培养基中的那些颗粒细胞怎么收集，因为会混有很多细胞碎片，大的碎片可以通过过滤或是离心除去，但是小的就不好办，我再查查其他文献吧。

luyue6453

回复 moluxingke 的帖子2 p1 p- q  @* F9 N  M
6 m- P: b3 o6 p7 F1 _: q/ c6 G2 q
不知道您要收集颗粒细胞有什么用，以前我养卵母细胞时，把卵子从卵巢中吸出来后体外培养，猪的是过22h成熟，将成熟的卵母细胞放到胰酶里，用自己做的针吹吸几次，卵丘细胞就掉下来了，这样可以避免有细胞碎片形成，这只是我的个人建议，你要的我没做过。

moluxingke

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- K' b1 Q4 |! t  i+ `
3 v8 i/ s' o6 X  r实验中用的条件性敲除小鼠，想做一些关于FSH或是LH诱导下颗粒细胞中的一些调控机制，所以打算用体外培养的方式来做做看，需要转病毒或是抑制剂处理，来对体内的结果进行一下验证。小鼠的COC可以直接用透明质酸酶消化，我现在就是想多收集一些颗粒细胞，毕竟敲除小鼠没有那么多，担心实验中不够用。