求助-小鼠颗粒细胞体外培养

moluxingke

最近在做小鼠颗粒细胞的体外培养，查了一些方法：
: ~) x% e! C  ^, Q3 u3 Z( v2 |$ IPMSG处理21-22天的小鼠，然后大约46-48h后取卵巢。
/ q; H. `2 t4 [2 k2 J! N. T刺破卵巢中较大的卵泡，使COC释放出来，然后用移液器反复吹吸，使颗粒细胞和卵母细胞分离，移走卵母细胞，将颗粒细胞离心收集。9 Z9 ]9 E' I0 F5 R
然后PBS洗涤一下，继续离心。
! K$ U, G6 O. tDMEM/F12培养基重悬，培养。
% n2 b( N* U! c0 t) G- t) b. f然后我想问一下：1  这种方法收集的大多是围绕卵母细胞的卵丘颗粒细胞，壁层颗粒细胞比较少，而且刺破卵泡过程中，有较多的颗粒细胞损失掉了，怎么才能收集较多的颗粒细胞，如果要铺一个12孔板的话，至少需要多少只小鼠？
! ^1 I! N; A) d# A' A    2 因为小鼠已经经过PMSG处理了，也就是说颗粒细胞已经对PMSG产生应答一次了，那么在体外实验中如果我还打算用FSH处理这些颗粒细胞，颗粒细胞对FSH的响应会不会有一定程度的减弱？
7 m$ R% P; t5 H) a/ Q9 w3  原代分离培养过程中要不要加双抗？- a& @4 Z0 [& C8 y# i4 S

dxb1985

Murine granulosa cell morphology and function are regulated by a synthetic Arg–Gly–Asp matrix
$ U3 V3 N( P5 w: A/ A/ U- }不知道这篇文章对你是否有帮助，用针多扎几次，颗粒细胞就出来了

moluxingke

回复 dxb1985 的帖子, h9 |) g* ?; W: N1 z0 |- s9 V
$ T" J6 n% [- k% D- G' P
谢谢帮助，多扎几次得到的COC会多一些，我现在很想知道扎卵泡过 程中散落到培养基中的那些颗粒细胞怎么收集，因为会混有很多细胞碎片，大的碎片可以通过过滤或是离心除去，但是小的就不好办，我再查查其他文献吧。

luyue6453

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  ?) M% S# |! V
不知道您要收集颗粒细胞有什么用，以前我养卵母细胞时，把卵子从卵巢中吸出来后体外培养，猪的是过22h成熟，将成熟的卵母细胞放到胰酶里，用自己做的针吹吸几次，卵丘细胞就掉下来了，这样可以避免有细胞碎片形成，这只是我的个人建议，你要的我没做过。

moluxingke

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) b3 p( G" q. B5 f; X* w% A1 x6 Q: V- C2 w" N0 P+ n
实验中用的条件性敲除小鼠，想做一些关于FSH或是LH诱导下颗粒细胞中的一些调控机制，所以打算用体外培养的方式来做做看，需要转病毒或是抑制剂处理，来对体内的结果进行一下验证。小鼠的COC可以直接用透明质酸酶消化，我现在就是想多收集一些颗粒细胞，毕竟敲除小鼠没有那么多，担心实验中不够用。