求助-小鼠颗粒细胞体外培养

moluxingke

最近在做小鼠颗粒细胞的体外培养，查了一些方法：, _% H4 `* z: V' h. [7 x: H, e' J4 `
PMSG处理21-22天的小鼠，然后大约46-48h后取卵巢。, G2 Q# m7 t& F3 V0 z2 c% T, }" ?
刺破卵巢中较大的卵泡，使COC释放出来，然后用移液器反复吹吸，使颗粒细胞和卵母细胞分离，移走卵母细胞，将颗粒细胞离心收集。  }! t: K' p+ D5 J! k  m1 A8 x
然后PBS洗涤一下，继续离心。
8 X1 \- I/ B9 N" E) X" GDMEM/F12培养基重悬，培养。+ ^$ u7 r5 \! n1 Z& F
然后我想问一下：1  这种方法收集的大多是围绕卵母细胞的卵丘颗粒细胞，壁层颗粒细胞比较少，而且刺破卵泡过程中，有较多的颗粒细胞损失掉了，怎么才能收集较多的颗粒细胞，如果要铺一个12孔板的话，至少需要多少只小鼠？
7 |+ _7 X3 X: O: y1 R4 Y    2 因为小鼠已经经过PMSG处理了，也就是说颗粒细胞已经对PMSG产生应答一次了，那么在体外实验中如果我还打算用FSH处理这些颗粒细胞，颗粒细胞对FSH的响应会不会有一定程度的减弱？
  P' y3 {+ Q, h3  原代分离培养过程中要不要加双抗？) i8 ~/ K8 C. j- f

dxb1985

Murine granulosa cell morphology and function are regulated by a synthetic Arg–Gly–Asp matrix
4 {1 o, @4 T9 ]# S不知道这篇文章对你是否有帮助，用针多扎几次，颗粒细胞就出来了

moluxingke

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  U0 y* ?: N5 Z3 |
. ?- F$ j0 S7 f7 ^5 P# r* F& Y; K0 T0 q谢谢帮助，多扎几次得到的COC会多一些，我现在很想知道扎卵泡过 程中散落到培养基中的那些颗粒细胞怎么收集，因为会混有很多细胞碎片，大的碎片可以通过过滤或是离心除去，但是小的就不好办，我再查查其他文献吧。

luyue6453

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8 s5 ~2 @( D( B2 J2 |
2 W; n$ [1 I! Q不知道您要收集颗粒细胞有什么用，以前我养卵母细胞时，把卵子从卵巢中吸出来后体外培养，猪的是过22h成熟，将成熟的卵母细胞放到胰酶里，用自己做的针吹吸几次，卵丘细胞就掉下来了，这样可以避免有细胞碎片形成，这只是我的个人建议，你要的我没做过。

moluxingke

回复 luyue6453 的帖子. C* ?0 g( \# t8 Q0 J0 X
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实验中用的条件性敲除小鼠，想做一些关于FSH或是LH诱导下颗粒细胞中的一些调控机制，所以打算用体外培养的方式来做做看，需要转病毒或是抑制剂处理，来对体内的结果进行一下验证。小鼠的COC可以直接用透明质酸酶消化，我现在就是想多收集一些颗粒细胞，毕竟敲除小鼠没有那么多，担心实验中不够用。