流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

- u& D; w! R5 E  M- u6 {* r. K* D
我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。
, D8 X/ w) Z$ G2 p/ }先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

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' ?+ t. x$ j$ V8 K& t6 o8 a: v; U: S, x+ l. F" q6 j
细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

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- s" f$ a' J5 G* h0 c- D" I' c
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 - e7 J, [4 ^. d
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
. y. i; N6 g: T% }(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
$ C" V( r9 {7 y/ Z, W& }4 c0 Y(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。0 S6 F: g: o6 W
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。8 `2 g+ q5 C) P) e2 w
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
9 h& l8 B# G  `5 a这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34
2 V/ J) D1 W# B最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

8 d# o0 s5 u# z4 c
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 ) Q5 q" c/ j. ~  e8 p$ I
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
% `+ Q1 b4 @$ A, _" C* ~- `0 v/ \(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
8 ?, ~2 i) w' B( m4 F) J8 O(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。  i' c& I( ~5 J" m2 o' [5 Z
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
2 z) j- i. M6 G4 Y7 K9 [(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
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rocfield

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8 a$ j) ]0 j2 a& H' ^
不知道您的这个流程是从哪里查到的？
, K' N" Q7 Y, H我们做的大致是这样的：
! S9 |( u4 Z* t4 o/ A1：收集的细胞用PBS洗一次；9 Q: F5 A/ w7 m5 R3 I
2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；
5 u8 x# F) J9 V7 D3 PBS洗两次
) V  A% Y- w* u+ g4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）. `! C. \9 G% \3 q# ]
如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

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5 @7 f  f' z5 t5 {' I. w% \5 c5 y) k( [3 J5 S+ k- V: p3 u/ A
谢谢指教

shaozi402

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& H) C' M% F5 G' g" N0 g7 D/ L: _+ M6 ~9 p9 U+ a. a# _' G1 H* r
检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？