流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

# D# i  P1 X7 {% t( {我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。( N1 [( G5 \! H
先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

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* ]3 l5 l& T) D0 }) x+ F, U# d, b( v4 y+ }6 r1 F, @; q. [
细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

回复 rocfield 的帖子! G( \# I  x0 G" Q) a8 y

8 X. E2 T  G' N& C6 Fhttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
) J0 |8 {8 l+ D3 o2 a! |% ]2 V6 X2 GA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：2 i5 |' R; k9 p: Y6 \& Z
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。( v* |# K, [  W5 y
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。1 C& I9 Z. x% N3 ~( r
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。; [: k* g( j" v- E) Y
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
* w# ^4 U3 x2 w7 b% h这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34
- l2 [/ {/ r& l% b% l0 @最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

  o" t; c! q! k2 H+ Ahttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
, S% \5 {7 b$ r$ fA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：7 T; ?# @5 l  w- \7 i6 o6 V
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。' g2 ?( w! l( Y* F; d+ L2 ^
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
% A5 e( |: x2 r2 k3 }(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
; w' r/ o' p' \' @(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。, q4 G3 e; [0 @6 D

rocfield

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. ~% O& Z2 H7 I$ f1 }0 d3 a2 u2 Z
+ s3 k' P* v$ O. e  u* v/ A* y不知道您的这个流程是从哪里查到的？
1 _7 h- |/ U/ a" Y5 @我们做的大致是这样的：, d' Z5 r0 J' @- `+ W
1：收集的细胞用PBS洗一次；. B' |$ \, S6 h5 P& x7 l
2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；7 G3 ~4 D1 d* p, ^. {1 f9 Q: `4 b
3 PBS洗两次
: l3 Z, B$ J" a4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）2 f/ |! L7 S9 ^0 e
如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

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( S! k7 a* O6 q! }
谢谢指教

shaozi402

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6 E! v* Z4 v, U# Z6 }3 `检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？