流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

3 _9 P6 _. b0 h: ^$ O1 K1 \  _7 {我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。
  q6 x% h) b9 s- V* A先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

回复 仰天 的帖子2 ?8 R$ F0 P- f/ b" C: O  C( ?+ U
: j" i5 L& B: |& |* J
细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

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5 G: J, T8 O) R( H9 v- b6 h5 M- e
" ]' P% C8 J5 t5 n! h2 z) u( }http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 + P: J% Y' @9 V, n
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
0 ^& j7 i) j% F9 t/ r(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。$ n7 }* R5 g$ |' b/ e0 G+ s
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。: D2 @, ~: y! |! _3 m& Z
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
: G; T, r: m/ b) P(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。% V; s; [8 C* i
这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34 * `* o& i: r, s" X, w* Q
最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

  `' z: L$ _: m+ Zhttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 * S4 z% O3 g/ u/ T  }# ?. @" n
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
7 S! k/ ^; o- Y( }, Z4 @(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
2 R( ~, m4 I" D$ S(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。% t# K1 N6 P* O' K
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。/ j  a8 l7 y' Y0 _+ ?- ~
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
' A" W( D% `3 K. \+ A

rocfield

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* z: f: A! ]$ Y: w' D- i9 Z+ f4 f  h. l, G! v- V5 {
不知道您的这个流程是从哪里查到的？
( O0 E  q6 E8 L! ]4 k9 z我们做的大致是这样的：
$ ?+ M3 ~* I5 N# b7 L1：收集的细胞用PBS洗一次；/ J' z+ b$ _9 t
2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；
; Q2 A$ O- f( W1 A7 T' `! m3 PBS洗两次1 v" u9 b5 ~; p! w
4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）4 c) P4 Y! W4 W1 A( r
如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

回复 rocfield 的帖子$ T7 M' n+ s+ `! z9 Y- J! \4 H

1 I7 E2 d. z( @  K谢谢指教

shaozi402

回复 rocfield 的帖子1 t8 K9 N0 V( k% l5 P& }
* K3 e$ t" q' x; p
检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？