流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

qing蓝qing

% D: W) ^" e# T( p3 _- z
我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？

ciweiyuan

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题

rocfield

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。  {& F- r& o( v' i6 C0 g; V4 K3 m$ N
先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。

仰天

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。

qing蓝qing

回复 仰天 的帖子: ~! {# h# i/ W# ~9 L) ?/ w" I& {* S
' m5 H2 x/ g( w
细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？

qing蓝qing

回复 rocfield 的帖子
/ ^$ w' F7 x  ]  x; ?' v  Y" O
/ B3 P5 g* W3 N$ y0 ahttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
" m9 \& Q, O; [A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
( W$ f: y+ }0 h(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
% B$ `: R1 u; C" ~6 @4 D7 u(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
4 K3 z. ]+ h; ]9 S4 A7 @(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
& }+ E- |6 A# w5 k0 U(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
8 X$ c; c% \8 y, l7 a这不是流式的标准操作吗？

qing蓝qing

仰天 发表于 2014-6-13 10:34
! ^8 R, V0 `) O0 F最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

& W! j1 O, C" }http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 2 @& e7 w3 F* H2 q0 c
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：+ ~1 [3 d+ A  Q
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
3 L; I8 D2 U/ T(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
* g1 e' Q7 [7 ^! w(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。$ K8 L9 E) @3 M0 a& C
(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。* E6 @1 L5 F8 _" l

rocfield

回复 qing蓝qing 的帖子- s! c4 Q" s8 P: e: t. C6 ]- V! `7 A
; y9 O7 B# h) e" Q8 I
不知道您的这个流程是从哪里查到的？
9 s! A: O/ R% R( s: h  c我们做的大致是这样的：9 A. t' Y/ F! Q# n" a# k
1：收集的细胞用PBS洗一次；. C! b; F5 n' l. X) M
2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；
# y8 F3 R# K% u3 PBS洗两次
5 p( d# s4 E0 \& ]. w4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）- O; [. P9 q, i8 r, k
如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。

qing蓝qing

回复 rocfield 的帖子! R- R) v. q5 |& _' x; o

6 q7 y9 S7 j( _/ \; s, j谢谢指教

shaozi402

回复 rocfield 的帖子+ R  H+ L( N5 g  I" |3 d
& A' ~0 C. r; C
检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？