培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

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我的操作步骤：4 o" r6 V1 {6 [4 z* C
1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】
' Y# l2 X$ }8 Y% K7 T7 x! `2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；: K  U! [8 |# K+ @* C& z
3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；
1 ^. O+ U( Y" J# Q5 G5 b7 g: Z4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；
9 T$ `& d0 T, w7 U: I( ]5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
9 E3 j% {5 O+ e6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；
! k' z4 a/ {, G& a# D7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；. Z0 P% f8 t; a, z, w. h$ |# ]
8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
3 O* w9 o5 v9 R9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。
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***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。- Y9 ~. p, t) @. F2 g

5 {: g' U8 u4 o- E5 l9 y, \我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
9 Q! D% q, J/ d  m6 H附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
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回复 jianglei_sd 的帖子4 [. D' @' w3 c
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啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

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回复 单个核细胞 的帖子
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好的，谢谢您的指点。。。

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回复 月_幻影 的帖子* f' ~3 y& a  i, i9 T

1 [; k( l% G  p) r1 y% ^7 I8 M好的，谢谢您！！我再等等。

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回复 frankhu 的帖子3 ~% f( @" b8 D- f
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我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？

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回复 屋檐上的乌鸦 的帖子% n, h4 \8 B: C+ q( H. l  ?1 g
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嗯，手术室离我们实验室进，我一般其实1-2个小时就开始做了，就是还没有结果。。。不知道到底哪里错了。。

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回复 frankhu 的帖子
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我第一次换液就观察了，没有看到细胞，以前组织块很大，会有大部分冲洗掉，现在小组织块都没有掉，贴的很紧，，但就是接着培养液颜色不变了。都不知道怎么改正。是组织块太小了吗？

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回复 1360501260 的帖子5 L+ @5 J/ U. o* C
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好的，谢谢您的指导！下一次培养我注意这个问题。

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回复 frankhu 的帖子
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好的，谢谢您的指导！下次我试一试你这个方法。

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回复 cyagen 的帖子
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' E2 ?& L- J0 s3 v* C; b! V) V) ]不是的，因为第一次养细胞，当时没有想那么多，应该是用专用干细胞血清会好些，我买的就是普通的FBS。现在换血清太贵，换不起呀。。。