培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

# Y2 [5 h/ ]* m
我的操作步骤：+ v- v* Q  d4 F. G
1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】
. _' K5 `' }: B9 B$ n6 r0 x2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；
$ i0 o; {. e' P. I( c7 @9 T6 I2 f3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；
" X: w# H1 u9 @, \4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；1 W) @/ o# n. k5 l' \- H
5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
4 C! _& S4 q0 g. H6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；. p) H5 c9 C. o; `# i& v
7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；4 I$ Q+ z, v0 e( y
8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；( u: v* `* z3 w) B' z8 Z3 G% a
9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。0 I+ S' y- O1 N

8 D! f' F2 i0 G) |3 S***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。
/ X7 g% W1 l! X" w6 i4 N( B9 i( b# E8 ^- s4 L
我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！7 y! a: ^/ W8 f+ t1 v
附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
. }1 I3 a9 `) A: L8 C7 W2 R9 f) Z

cloud100

回复 李敏拉 的帖子4 W0 X3 v7 \1 J! S) b

2 r5 D! b! g1 \, ^; g' O# r9 \呵呵。我后来成功了。# m/ X- L7 w! p0 P! D
我认为最关键的是，一定要最新鲜的脐带组织。要生下来就立马运输动手实验，越快越好。然后取了华通胶，剪碎，直接放到培养皿上面，超净台里面风机吹2-3分钟，把组织块周围水吹干了，然后立马小心滴加培养液，刚刚保持组织块湿润就OK。' p, ^) r# L* U9 y$ u+ K! v6 R  a
过24小时小心滴加培养液，浸没培养液，然后就千万别动它了。
9 `" ^* g: k; j: L( A/ k) W隔着培养箱的玻璃门观察，直到培养液颜色变金黄了，可以半量换液。反正前两周，千万别没事去动它，除非要换液。就这样等到它长出来。

cloud100

回复 fengtingyong 的帖子0 e9 ^6 B- j9 h5 G

: b% V- F4 r6 _. m# v) k* U哈哈，谢谢呀！后面我成功了，发现关键之一是，要让组织块尽早接触培养基。

fengtingyong

操作应该没有多大问题，你在接种时你的组织块应该加少许的培养液润一润组织块之后倒置，隔夜换液，应该会爬出来了，以后看涨势添加培养液。希望你能成功！

李敏拉

培养几天后换液时发现有粘稠液体，换液时把它吸走了，然后换上新鲜的培养液，这样可以吗？那粘稠的液体：好像是组织边缘融化于培养基中，也就不可能会贴壁，
) k" A1 o5 I% F! e) I7 I9 {5 E吸掉可以吗？# L) m5 H  j0 u# _0 Z& u

baby00000003

时间还早，耐心等~

cloud100

回复 yinff1988 的帖子
8 Y& j2 B0 P) z  H1 d: q
3 R$ a7 ?& s6 Z' [: w/ H我还没有成功，你懂的。不过无论是文献还是论坛里的经验，有人用DMEM/LG成功的，应该影响不大。

yinff1988

现在大家都用F12吗？不用DMEM/低糖吗？

lovesxj941

回复 cloud100 的帖子/ ~: N; o* V( q1 E+ s
$ U( R6 h2 f7 Q* f9 C8 R6 W
恩，酶消化法更好，必须的。

cloud100

回复 yongganyixie 的帖子% j* l& m+ }) _; _: i7 l9 a. x/ R9 Z' M
- y# j! r+ v7 d7 Q* ]0 S
嗯， 第一次换液是第6天，后面看培养液变金黄色换，大概4-5天的样子，应该不是粘稠的。比较清亮。