培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

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我的操作步骤：7 [. H, I2 [% t' H4 Z
1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】2 k' A" A& ^0 m1 m6 ^1 X. j
2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；" L3 e" o' F+ z  N. ?0 w
3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；
5 `7 m0 O& T5 E% h- P4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；
8 M* C6 M1 r) {2 ^% x% U$ R0 g) t& y- }5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；7 p- n, i5 q4 B& s$ l  v  a1 M4 Q0 m
6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；0 C! r* h% o6 G, R
7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；0 p- J4 r& x* z/ I: e% ^% l; _" h7 k
8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
# z! w3 y( u7 f% m) q9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。+ R- G/ e2 r4 P; Y7 A
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***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。
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6 I5 d& S6 m) A$ V( _% j, r- u我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
4 z) B" n2 J% W+ ~7 c5 X6 l附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
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jianglei_sd

直接将剪碎的组织块转移到T25瓶子，不用FBS润湿。
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5 ]7 [- \; T, f2 q0 G5 V/ |另外2,3,4步操作要快，不用剪的太碎，不要在冰上太长时间。

单个核细胞

# e$ m9 @9 E  R$ F) H+ N: X* i

2 Q6 r3 {) g& [3 O0 S回复 cloud100 的帖子: m/ r0 V+ i, B# [- S8 b
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请参照这篇文章的方法试一下：$ G% r: T. A1 j

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另，推荐阅读：# z' D" Y0 Z0 s

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• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：+ F1 Q; C+ }2 U0 u( \+ W
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 请教华通氏胶的剥离：5 e( W9 |6 T4 i7 E) [; S
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• 应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞：: E1 r" {/ X) t$ b  S
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• 脐带间充质胶质的备置：3 Q+ B: F- [* }3 e# K1 }* d
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质细胞贴壁法出芽率怎么这么低：
  + g8 F# b) v7 G; {  v! _http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质贴壁法到底几天换液：
  - J5 t8 K1 G: L5 Lhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?
  3 K5 ^4 `# w' L9 i# Fhttp://www.stemcell8.cn/forum-re ... 79-pid-644496.htmll

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

frankhu

看了楼主的实验过程，觉得太过于复杂了，脐带间充质贴壁培养相对来说比较简单，取回的拨完脐带，剪成米粒大小，然后均匀平铺在瓶底，加的培养基要浸润组织但不浮起来为准，培养4小时后补加培养基完全浸没组织，继续培养，然后观察到细胞游离出来，培养基颜色变黄后首次换液。接下来就是隔天换液，待瓶子长满后传代。

cloud100

回复 jianglei_sd 的帖子
7 i8 i' Y0 M4 J! j; w5 a1 r* H; k$ j  Y  S: T1 p- E+ [
啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

cloud100

回复 单个核细胞 的帖子6 s' B. v& o& g. P

3 O! b  a7 u6 g4 c1 a" \" b好的，谢谢您的指点。。。

cloud100

回复 月_幻影 的帖子& G/ b$ b/ G: \: c, R6 n( y% l4 a

) i/ C. \) w* U% W, G好的，谢谢您！！我再等等。

cloud100

回复 frankhu 的帖子
) m# u# d1 ~7 G. }9 m& U
! t  t) w. f& o6 }8 E( F" D我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？