求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊
% P0 P% s, v  x, ]* V" Z培养材料：/ g7 f; ]' `# d- H9 @
无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆( O8 @5 Z- \  Z, T. f; _2 d  ~
细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）
) w( F& m. a7 b7 Y1 q2 c8 [% w& O; l操作步骤：
  v( ?& M/ j" i+ E+ S5 o2 A2 F$ T9 X1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，  i. v: ^. u& w5 D! c' X4 `
2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。+ A& P* t; K2 k; g* u$ k
3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。
3 S, l+ ~/ G# G! A; D4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。6 `& n& H! _. z3 T6 b
5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。0 D, V. Q5 b; S$ P; r1 Q

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子
, R) Y% b% M' ]$ s. ~
0 D* j2 k" G' t8 f, I4 `. x90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子4 U: y8 g4 Y# d
  e( M( y5 n( ]) j- F
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子
% t  U( h9 M' y8 N; S5 Y0 K* q) G7 W; c( k/ O) s& e
请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子- A: O/ F8 b- f/ p6 W

9 r. j# J! z/ ?9 c细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24
5 Y& Q8 K3 Z' {0 h! F9 _/ N回复 wind789 的帖子
2 S% v# z! k- Z1 N& Q' |6 y' `! F' f
20%左右

, _# g5 S% X$ \2 P" ]; M3 n2 l( o3 _这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

: i0 X9 I, Q+ R0 o% t/ O/ {
& w% u7 `* a" E1 H回复 yangpan521 的帖子" H2 \2 I; J1 o9 |" L( ~

! h, V6 ?8 J' N9 B/ O推荐阅读：  V$ \* V$ @0 g. N
+ [0 a# L+ X4 v8 h# @3 l- c, `) ~
Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells
( U( R6 C9 m, U7 E: ?) z) B. `http://www.jove.com/video/2540/e ... an-peripheral-blood
9 [3 a1 j0 c; p' R5 K
$ w1 }* P. y- F; u1 M( _方案：. P7 z0 d, D  q1 U2 }, h! W
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物料：