求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊
, K; s7 h* Y6 s  l$ r: N0 X: f* G( l培养材料：  j/ J& {" d. M# u$ E6 e. M
无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
/ w" n8 \6 l6 v/ [7 O7 X细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）. L) `# {* G# v' ?9 P# N5 K' l( m
操作步骤：( @* k+ K1 H, L! K' _' Q
1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，
: |- u1 Z0 i: [7 Y7 a% u/ `2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
# e# s+ q5 Y; N. t; c( f3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。
% e  x" t* D  X! x; x) M4 B4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。$ M' q, }! a$ t% x% G) Q( t9 Y% L
5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。# i" `, n* ^4 U3 b8 `6 {3 x6 k

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子
/ u' ]6 _- j% @% d. G( Y5 a* w  O; z& C  A+ Z1 x; Q/ [/ M. l
90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子% P( d* D; m' F3 t: L: o

# Y4 G3 a1 A' A' l" U20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子7 b: `4 r) N: y; u0 [

; F8 p* \8 F# \, P请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子
# A7 k1 i# A1 S3 a0 }9 \& t: S$ W* r& a) h- s7 {8 {0 P
细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24 ! b$ j8 x' _  N# C% U
回复 wind789 的帖子
+ ~; i$ c3 d7 A3 w0 c( b0 Q1 a9 o/ E
, C& T5 a8 c% s/ r, j20%左右

# J0 |0 b& T8 i. a% i- o这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

/ s: i: q. ]7 ?8 i* K# U" d/ s, }- l! P! L( J  C: y
回复 yangpan521 的帖子1 E8 |% p/ \' c2 O: Y
  N1 E+ b9 J+ s: V' c3 R
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物料：