关于在MEF饲养层上的小鼠iPS的RNA、DNA、蛋白提取的问题

zhd0506

复苏的小鼠iPS到小鼠胚胎成纤维饲养层上，现在生长状态良好，请问如何提取才能获得更纯的克隆的RNA、DNA、蛋白？因为克隆是小鼠的饲养层也是小鼠的，所以怕是同种动物细胞会污染克隆的RNA、DNA、蛋白。现在想得到更纯的RNA、DNA、蛋白。* E/ x' l7 x+ H+ D8 i$ s
1）我现在只知道用差数半个小时的方法去除饲养层，还有没有更好的方法？% F% ]( d6 R+ d2 Q6 ^  |
2）如果不用饲养层培养，复苏时候用Feeder-free培养基直接复苏可以吗？
  ?& r2 q  m7 M2 J' ^  |, {3）Feeder-free培养基用大家推荐用哪个公司的？具体名称是什么？培养基贵不贵？

creatine

可以不用feeder，用ECM或者Matrigel(拼写不知道对不对），不过长的效果没feeder好。

zhd0506

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4 w4 \( A& d5 M) Z, Y$ j% G* P
2 ^/ T: u, {, h7 k不客气

孤野知—少帅

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6 A5 z' L8 E/ L( P6 H0 V4 A) c
8 ?2 `/ x: ~5 L+ Q好的，我试试。谢谢你！

zhd0506

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; S6 R6 v3 b5 t/ K) D" A& q6 O0 w( E1 J& U' _/ G; w
:P你说的很对

zhd0506

回复 孤野知—少帅 的帖子* L1 s% M; k! Y* r. m3 t

9 }; r% k7 f8 V# d7 t4 z0 [9 [嗯，约半个小时你会在显微镜下看到贴壁的MEF，飘着的散开的iPS，具体效率没有算过，分离后就直接提取DNA、RNA等了。你可以试着看看效率如何，我当时是在显微镜下看到大部分MEF都贴壁了，还有有就是不一定是半个小时，你可以根据你自己的细胞调整时间，半个小时是我们实验室自己根据细胞总结的。

孤野知—少帅

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4 b' p8 X- k0 ~( B2 S, B
: |5 W7 [# y7 J) O' o6 c) z就是说培养半小时后再吸取的培养基中是iPSCs了？这种分离方法最后的分离效率能达到多少呢？

ciweiyuan

用Feeder-free培养基可以直接复苏，我记得好像日本有家公司的无滋养层培养基不错，具体名字忘记了，不好意思。

zb_ming

回复 zhd0506 的帖子5 K! Q1 G% B5 |& s/ j" Y- F  m

) \3 U5 n, ]5 E" X应该叫差速贴壁法。

zhd0506

回复 孤野知—少帅 的帖子3 j: D( v+ f) X. O& K$ S

0 M( f6 l) G" T( e) n! X差速分离，简单说就是把带有饲养层的克隆整体消化下来，离心，弃液，加入培养基放于空皿或者空培养瓶中培养半个小时，在用移液器吸取培养基至离心管中离心（此时皿中的饲养层半个小时大部分基本就贴壁 了，剩下的克隆还悬浮在培养基里，可以将皿扔掉了），接下来就可以直接进行DNA和RNA等的提取了。