关于在MEF饲养层上的小鼠iPS的RNA、DNA、蛋白提取的问题

zhd0506

复苏的小鼠iPS到小鼠胚胎成纤维饲养层上，现在生长状态良好，请问如何提取才能获得更纯的克隆的RNA、DNA、蛋白？因为克隆是小鼠的饲养层也是小鼠的，所以怕是同种动物细胞会污染克隆的RNA、DNA、蛋白。现在想得到更纯的RNA、DNA、蛋白。$ o* s  L# C5 r( |
1）我现在只知道用差数半个小时的方法去除饲养层，还有没有更好的方法？8 `, d  T0 @' B% B: j1 C, x4 q
2）如果不用饲养层培养，复苏时候用Feeder-free培养基直接复苏可以吗？  a$ K9 y+ g) z- ], T* A
3）Feeder-free培养基用大家推荐用哪个公司的？具体名称是什么？培养基贵不贵？

creatine

可以不用feeder，用ECM或者Matrigel(拼写不知道对不对），不过长的效果没feeder好。

zhd0506

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不客气

孤野知—少帅

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1 j% h! I. X$ `, G7 c1 D; l7 z$ p& C好的，我试试。谢谢你！

zhd0506

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:P你说的很对

zhd0506

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- H) S2 c8 Y6 u9 H嗯，约半个小时你会在显微镜下看到贴壁的MEF，飘着的散开的iPS，具体效率没有算过，分离后就直接提取DNA、RNA等了。你可以试着看看效率如何，我当时是在显微镜下看到大部分MEF都贴壁了，还有有就是不一定是半个小时，你可以根据你自己的细胞调整时间，半个小时是我们实验室自己根据细胞总结的。

孤野知—少帅

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& a, T8 {! k! @$ {/ M$ x就是说培养半小时后再吸取的培养基中是iPSCs了？这种分离方法最后的分离效率能达到多少呢？

ciweiyuan

用Feeder-free培养基可以直接复苏，我记得好像日本有家公司的无滋养层培养基不错，具体名字忘记了，不好意思。

zb_ming

回复 zhd0506 的帖子/ C  f, `0 N: n4 r" F( E; F! D1 B

, u8 I% w5 p/ U1 `' X/ g应该叫差速贴壁法。

zhd0506

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( u9 H5 t! N/ U4 W: G' D9 t& f* u, y7 y2 o
差速分离，简单说就是把带有饲养层的克隆整体消化下来，离心，弃液，加入培养基放于空皿或者空培养瓶中培养半个小时，在用移液器吸取培养基至离心管中离心（此时皿中的饲养层半个小时大部分基本就贴壁 了，剩下的克隆还悬浮在培养基里，可以将皿扔掉了），接下来就可以直接进行DNA和RNA等的提取了。