关于在MEF饲养层上的小鼠iPS的RNA、DNA、蛋白提取的问题

zhd0506

复苏的小鼠iPS到小鼠胚胎成纤维饲养层上，现在生长状态良好，请问如何提取才能获得更纯的克隆的RNA、DNA、蛋白？因为克隆是小鼠的饲养层也是小鼠的，所以怕是同种动物细胞会污染克隆的RNA、DNA、蛋白。现在想得到更纯的RNA、DNA、蛋白。
* d. m, l2 Y$ o5 Z1）我现在只知道用差数半个小时的方法去除饲养层，还有没有更好的方法？
  l5 V4 L- _" |# w1 L2）如果不用饲养层培养，复苏时候用Feeder-free培养基直接复苏可以吗？
* e0 w; O& p+ K3）Feeder-free培养基用大家推荐用哪个公司的？具体名称是什么？培养基贵不贵？

孤野知—少帅

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  F' @- l5 |; [2 a我也遇到同样的问题。我的饲养层是CF-1的小鼠胎儿成纤维细胞，而iPSCs则是猪的，后期实验我要获得纯净的RNA/DNA，这样很可能会存在污染。我想过用流式先分选，然后再提RNA/DNA，但效率也不会100%，不知道还有没有其他更好的方法。

zhd0506

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  Y( E3 v/ i  ^1 A* W4 ~
9 X: V% N5 b3 ]. \& u$ b" a. Q你的还好吧，毕竟是两种物种，用差速的方法就行了，提取的DNA和RNA在做PCR之类的实验时候引物不结合小鼠的。而我的是同一物种，DNA和RNA是一样的，污染相当大。流式的话我们实验室还不具备条件，我们只能做分析不能分选

zhd0506

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+ w, v. _# ^$ D3 V9 u% B3 R0 z6 |2 I7 h9 x
你们用过Feeder-free培养基吗？

孤野知—少帅

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4 r$ r3 l( J! E; m. A如果是用于后续的PCR那是没什么大问题，但我后续试验设计引物的，没有特异性区别的地方。Feeder-free的培养体系我没做过。我想向你请教一下差速的方法是具体怎么做的，可以吗？

zhd0506

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6 m  `  L/ q. L4 n3 h0 t" Z* j差速分离，简单说就是把带有饲养层的克隆整体消化下来，离心，弃液，加入培养基放于空皿或者空培养瓶中培养半个小时，在用移液器吸取培养基至离心管中离心（此时皿中的饲养层半个小时大部分基本就贴壁 了，剩下的克隆还悬浮在培养基里，可以将皿扔掉了），接下来就可以直接进行DNA和RNA等的提取了。

zb_ming

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: c2 ^7 W; `. f* C- i应该叫差速贴壁法。

ciweiyuan

用Feeder-free培养基可以直接复苏，我记得好像日本有家公司的无滋养层培养基不错，具体名字忘记了，不好意思。

孤野知—少帅

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5 E/ g/ c: S9 \! h( ~就是说培养半小时后再吸取的培养基中是iPSCs了？这种分离方法最后的分离效率能达到多少呢？

zhd0506

回复 孤野知—少帅 的帖子% W1 m7 V& G0 V8 g0 [+ v" |) c- O

7 D; f7 U1 W' g( X" U5 ?6 o: i嗯，约半个小时你会在显微镜下看到贴壁的MEF，飘着的散开的iPS，具体效率没有算过，分离后就直接提取DNA、RNA等了。你可以试着看看效率如何，我当时是在显微镜下看到大部分MEF都贴壁了，还有有就是不一定是半个小时，你可以根据你自己的细胞调整时间，半个小时是我们实验室自己根据细胞总结的。