求助，原代分离羊膜上皮细胞不贴壁

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求助！！！我原代分离的羊膜上皮细胞，镜下能看到很多细胞，可是！！！他死活不贴壁！！！过了3天了还不贴！！愁死了，我分离了好几次了，细胞现在能消化下很多，但是就是不贴壁，我培养液是加了10%血清的，求做过的前辈帮分析下原因。9 O5 Z  K/ X3 ?' I& L) ]$ O) V/ |
我的protocol是：洗净羊膜后，于0.05%胰酶37度水浴消化10min后弃消化液，再用0.25%的胰酶37度水浴消化20min后，离心收集，过滤。重复消化3次后种瓶培养。也试了用0.05%的胰酶37度水浴消化20min后，离心收集，过滤。重复消化3次后种瓶培养。都能得到很多细胞，但是也都不贴壁...求助！！！3 `1 x! t: t- h/ ~) U6 u( E' C5 o% E

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回复 qiaozhong.9876 的帖子0 W5 p: I0 Y* d# w+ K
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是羊膜上皮细胞，加了因子的，10ng/ml的EGF，是因为重复消化的原因吗？可是消化时间短的话我怕得到的细胞太少啊，那样不是也不能贴壁吗？我查的文献基本都是消化20min什么的，我就整个那样做，但是细胞也不行。应该不是羊膜的问题，因为我做了两次了都不行，而且是同一个问题，就是细胞很多，但不贴壁。我现在思考是不是我培养液的问题，你之前做过吗？培养体系是什么样的啊？  - |5 E* I5 p3 D6 {! q5 |
之前问了个老师，他也猜我这是消化过度的问题，我之前都没做台盼蓝染色的，下次做的时候再试试吧。唉，愁死了

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而且我查到说胶原酶对上皮细胞的分离更好，但是我看大家做的好像都是胰酶消化时得到的羊膜间充质细胞比较少，加了胶原酶之后就会得到的羊膜间充质细胞比较多，难以得到比较纯的羊膜上皮细胞，所以想知道有人用胶原酶消化羊膜得羊膜上皮细胞的吗？

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回复 一转身的距离 的帖子% j. Q* @' G. z7 f8 b0 `
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我试了0.05%的胰酶，与0.25%的胰酶操作步骤相同，但是都不贴壁

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回复 qiaozhong.9876 的帖子! a- s" k# P2 j3 M2 ?% v- o
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你这样不会消化时间太长了吗？我现在就是怀疑是消化时间太长导致细胞不贴壁的...而且初始你去血之后的羊膜是不是有点发白的那种很薄的膜？我怕消化10min后弃掉的消化液里有大量上皮细胞啊...我用的培养液是promo cell的一个培养基，基本不能有问题。血清是gibco的，也不能有问题

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那你们消化步骤是如何呢？重复消化吗？我怕我消化时间太长

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回复 alicia_86 的帖子* J! s8 p/ @' H8 h
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胶原酶消化下来的不是大部分是间充质吗？培养基应该没什么问题，像EGF，血清这类必需的培养基里都含有了

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回复 qiaozhong.9876 的帖子
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我想问问你，你取得的羊膜是一层特别透明的吗？我最后取的是一层很透明的，特别薄的膜，我选了那个进行消化，贴壁了倒是，但是明显不是细胞，不知道是什么，碎碎的，我就怀疑我取得这层是不是不对。我是用载玻片把带血的一面完全给刮掉了，然后剩下一层极薄的近乎透明的膜，特别容易破

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回复 coffee.cat105 的帖子' Q6 b5 D6 U1 F" C' P

* }0 O& m8 j, L要用胶原铺板吗？...我是直接种的，但是不贴壁...