求助，原代分离羊膜上皮细胞不贴壁

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求助！！！我原代分离的羊膜上皮细胞，镜下能看到很多细胞，可是！！！他死活不贴壁！！！过了3天了还不贴！！愁死了，我分离了好几次了，细胞现在能消化下很多，但是就是不贴壁，我培养液是加了10%血清的，求做过的前辈帮分析下原因。2 E& O: H& S& G7 g( c) d
我的protocol是：洗净羊膜后，于0.05%胰酶37度水浴消化10min后弃消化液，再用0.25%的胰酶37度水浴消化20min后，离心收集，过滤。重复消化3次后种瓶培养。也试了用0.05%的胰酶37度水浴消化20min后，离心收集，过滤。重复消化3次后种瓶培养。都能得到很多细胞，但是也都不贴壁...求助！！！# q( x% |+ _/ z

qiaozhong.9876

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我想问一下你的是胎盘羊膜上皮细胞还是什么？你试试培养基里加20%的血清，不知道你的培养基里有没有加因子，这个很重要，我觉得你重复消化，细胞有可能死了，细胞死了也不贴壁，你做个胎盘蓝染色，看看细胞死的多不多，还有一个原因就是这个羊膜本身的问题，有的羊膜上的细胞就是不贴壁

听不到

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是羊膜上皮细胞，加了因子的，10ng/ml的EGF，是因为重复消化的原因吗？可是消化时间短的话我怕得到的细胞太少啊，那样不是也不能贴壁吗？我查的文献基本都是消化20min什么的，我就整个那样做，但是细胞也不行。应该不是羊膜的问题，因为我做了两次了都不行，而且是同一个问题，就是细胞很多，但不贴壁。我现在思考是不是我培养液的问题，你之前做过吗？培养体系是什么样的啊？  
  Z4 p% o4 P& v, N1 A7 K* o# Z; y之前问了个老师，他也猜我这是消化过度的问题，我之前都没做台盼蓝染色的，下次做的时候再试试吧。唉，愁死了

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而且我查到说胶原酶对上皮细胞的分离更好，但是我看大家做的好像都是胰酶消化时得到的羊膜间充质细胞比较少，加了胶原酶之后就会得到的羊膜间充质细胞比较多，难以得到比较纯的羊膜上皮细胞，所以想知道有人用胶原酶消化羊膜得羊膜上皮细胞的吗？

一转身的距离

个人觉得你的消化下手太重，0.25%的酶浓度太高了吧？另外消化时间太长对细胞的贴壁能力会有直接的影响。

yuanyecat

胰酶太厉害了，第一次可以用胰酶，但是第二次消化用不那么厉害的试一下，例如actutase。还有检查一下培养基是不是有问题

fancys1028

胶原酶消化的话  得到的是间充质啊   做原代一般我们都用的是 含0.02%EDTA的0.05% 胰酶

qiaozhong.9876

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" [# O: o- \9 [我现在一直在做胎盘羊膜上皮细胞的分离与培养，我分离的细胞基本上很少有不贴壁的，我一般胰酶消化10分钟后去掉再加胰酶消化一个小时，没有重复消化，在消化半个小时后摇一摇继续消化，我觉得是你的培养基和因子的问题，不知道你用的是什么牌子的培养基和血清，血清最重要

听不到

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我试了0.05%的胰酶，与0.25%的胰酶操作步骤相同，但是都不贴壁

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你这样不会消化时间太长了吗？我现在就是怀疑是消化时间太长导致细胞不贴壁的...而且初始你去血之后的羊膜是不是有点发白的那种很薄的膜？我怕消化10min后弃掉的消化液里有大量上皮细胞啊...我用的培养液是promo cell的一个培养基，基本不能有问题。血清是gibco的，也不能有问题