小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：' j" x. o- `0 g) W# e0 h# A2 i; q
: X  J# j  {! d( e! Y" Q
相应的pMX-GFP对照：
. A% e4 D. x: d
& ~3 W2 n; G+ c  ?: F病毒侵染3d后：
5 q/ f" @* d: a- n2 N+ A8 j: ^
' o4 B) {, ~) f$ F+ {到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。; ^+ Q9 K$ ^! [0 N
第9天细胞形态：) W) T3 E% {9 r+ L3 s

0 o. F9 @4 m, h' Y7 A- Z0 t; @- ^, W* j2 L2 q9 V
正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。9 u7 }! e3 K( T: {
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。7 q+ y. s8 k2 ]- M2 }; _
分析后，发现可能有以下原因：, W, N- i/ V' N; T/ j  v* ^/ A
1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；6 j! p! H, g% _2 B+ O  z
2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；9 v2 D- ?& ?) X
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。
3 \: R2 \' G/ H3 T5 F* k4、其他原因。
9 w: A8 }6 p% L" w; K( M希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？
8 ^! y- v1 A, `$ r) _: w
/ i5 ], k. Q* s8 u- b补充内容 (2015-2-6 16:45):4 F9 B% L/ @' E  T# m
发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

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) [# S" ?: K+ U- a0 Z7 D( @. ?/ X
" V" t) `0 {1 D  J7 F, M" U从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的; y- o! P, U* T# u
小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧
% |) Y4 Y  w( i7 a6 a# Z. z; H; N' G1 y
补充内容 (2015-2-10 14:05):. Y7 `: ]2 H6 b: W" Y8 C
第九天- -

宋红卫song

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1 `- {  g  \* s! Z
1 H* e% F- b& n嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

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( k1 ]! ?$ b7 s  u/ Z" }  G3 i7 W0 Y
嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

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$ n" J7 y+ k) K% @: s9 `
* K, `# T# C. }+ U. V- H+ W嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

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5 l9 S. m" h6 u0 l
+ n' t8 ^0 y* n- U支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教