小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
+ f; V+ F% {- b0 |6 B
& j7 ^; h! J5 R* J7 k相应的pMX-GFP对照：
6 x+ b. J% a( O( K$ i% p2 ^. B9 z" U
  T( [! [; D% _6 s) P" b" D/ D! k: J病毒侵染3d后：
- h& \- Q6 |+ G, c6 b+ M5 T) n  q; S- K7 t2 l
到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。1 g# X# [+ @& k6 c7 L
第9天细胞形态：
; w8 O, W+ I% M' W$ N3 t; ?% X0 r6 X/ p- _% `

' O8 @" Q& H1 ~9 q! |# w正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。) e8 t% I& E# E! T- S; l4 T
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。
+ r! I* @8 c/ @9 Y. |2 [+ A分析后，发现可能有以下原因：
9 N1 {9 C. R" F" B1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；/ X, W. t- [+ W3 r+ s7 A' A
2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；
- `* X- m* M3 ]3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。7 X, j3 Z2 }# y5 T) B1 M5 ]
4、其他原因。; h) O" u, Y2 `, k
希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？
5 y8 b: @* Y/ S  W. y9 D  s: n
8 S) }5 P9 ^5 e0 v1 d  F8 [补充内容 (2015-2-6 16:45):
" O: {) q$ \. p0 g0 r3 k发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

回复 宋红卫song 的帖子
& l2 D1 n1 E9 g# }0 c; h2 S/ V0 c+ Z/ g0 Z5 O
从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的  [  f( N2 g( _% V" w
小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧
/ _' L0 J8 ^& c. G6 P1 _; w0 X! @6 s( S% h& n* }$ D& I
补充内容 (2015-2-10 14:05):! K: C$ y% T6 Y6 [2 `, n
第九天- -

宋红卫song

回复 scottist 的帖子
$ J- d& [4 V  y" X& Z" d" ]
3 t3 }+ B2 V$ l: ]0 W嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

回复 saifast00 的帖子
1 f) m& c5 u& _: y* K1 A, t
( P3 u1 |% T6 k( z嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子" [! G# Z' E( k0 F/ }2 M9 p
2 Z: W9 `" }1 H( }  Z
嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子' [- b  u+ [$ E: h2 w
5 N/ O- l: X& v. K0 v
支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教