小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
2 e  f5 y, K& c0 I- U2 u# W: g
相应的pMX-GFP对照：
) h# l9 M; H# Y& l4 \" {5 g1 ~1 @
) d% m) D8 N$ \' d: c病毒侵染3d后：
9 I5 k3 E2 y# k4 q  I; [; N; H  E+ U2 F% `  S4 x* u: z1 a
到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。6 W, G6 p  i4 }+ j* ^3 Z0 a& ^
第9天细胞形态：
+ q6 ]; n; _" }$ u: @# V" i; m( b- ~) g$ t+ ~/ h  r# \( O

# ?( n1 k* d. l正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。. H. ^7 c& M- r. ?
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。
$ w  O, c* g" g2 P, ^分析后，发现可能有以下原因：
5 g# |, B( a8 e' W) g5 t1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；
; L5 `4 l7 O! {' n& T0 q" \7 ?. w2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；8 b. W, Y+ b6 h8 i; i: ?- j
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。$ u& s# V& D4 i3 `$ t& ^1 \, w
4、其他原因。5 n# B6 k) p/ @2 L( j; D& P7 n
希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？
# Z9 g9 e, N( t; i6 N; F0 D: h0 l, m% z/ ^* m+ K; a6 l4 U
补充内容 (2015-2-6 16:45):: i# A0 w3 Q3 F" Q" T. U4 W6 Z
发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

回复 宋红卫song 的帖子
1 j9 ^; B; @: h1 }4 B
# k& v) [& A3 |9 `  k从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的0 u8 q/ U( f+ w8 ~7 d4 C- X+ y
小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧
4 U" J* y8 T! e0 {* g
/ Q1 O; I  x5 K" f: U% Y补充内容 (2015-2-10 14:05):" q7 v" O8 X& c
第九天- -

宋红卫song

回复 scottist 的帖子
+ K7 O, _* A$ d
2 S# v- A( c. i嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

回复 saifast00 的帖子2 l8 u9 `1 k) i6 c: U9 P  }
0 i! }, q, L3 }  O* E4 k% V9 f( m; W4 h
嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子
  M% w! n5 F; W/ k4 o
0 O& ]3 r( V) l3 w; L$ Z  E$ v3 U+ H嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子# p( h' z# }& A1 g+ O

/ z3 \2 c8 r; R( t支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教