小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
8 P7 e# t. U- g" H
; O. g* N5 I' J6 r相应的pMX-GFP对照：
: [% @3 l: [% g1 y# y
% b. R) [7 g* {病毒侵染3d后：( F8 g0 D3 i' ]2 [5 k3 \3 l6 o

! i7 s/ T) h) ~" d  H" a4 m: f到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。9 A( K% ~& I8 \+ b8 X8 [
第9天细胞形态：/ T8 u8 t& p1 j; z0 S1 F" R
- h/ @0 |* a! m8 T5 m6 c- V
2 W3 }2 P) {* L8 }6 g+ ^9 ]& g
正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。0 S/ Z, B/ T. U- J; d  U
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。
. {% W; X7 c7 n$ r+ l. g% D分析后，发现可能有以下原因：
/ O! U0 d! ~6 ~  d& f& L4 p1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；5 ?( @% J: E! {( t7 H# l
2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；  }* ]0 B8 G5 a9 |3 ~9 Y0 b3 b& U
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。
9 T& ]) i4 Z3 S0 g4、其他原因。
& M. l  ]8 G( G; I% j. j希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？
! @+ r% w, B# q( ]
) P4 I2 b4 Z' P% R7 t6 Z2 a; B- y补充内容 (2015-2-6 16:45):
! g* ]  `  x2 E" P5 v# W发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

回复 宋红卫song 的帖子* B. q  g& A$ x+ B

: _1 T' ^8 }7 W/ w! U' @$ q# X从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的4 n# b9 [- A- X" C
小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧& }2 ], F9 i) k$ Y* R- K( d
5 |. s) T% G( N5 j' q4 p( U6 S" P
补充内容 (2015-2-10 14:05):
) {, [& Y" @* Y" U  P4 _! v5 T第九天- -

宋红卫song

回复 scottist 的帖子9 r9 x: g& G: R* D9 W" m
$ ^7 ?1 d6 T6 H: j& q/ @$ j7 a
嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

回复 saifast00 的帖子* m3 Y5 ^7 G* p
$ D1 _! T1 N' Q
嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子( o8 Q: W2 N7 ~$ [- F" }
" l2 L! B5 Q( b/ Z7 e7 Q3 x, e
嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子
3 g- W0 o9 z. N: u9 f) g0 S8 s
  \2 {4 ]0 Y0 r# Z# y; {支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教