小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
# x( N* p! {5 `+ `( e1 ?
( _$ }4 h' M$ n: b3 A# x2 S! ]" |相应的pMX-GFP对照：
7 Z3 r, t) O6 C/ G1 j: |; b1 J( L" a5 c& [" y( M
病毒侵染3d后：, A" D; k! y( t2 b% R, @  E' Q

8 q7 M; p* ?1 O- X$ R- d到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。4 c5 a  h2 p. d) |) h
第9天细胞形态：
) ]6 H6 D: `: t' `' K8 R
  P% G) O. k% a) d* F. ^5 V  E/ b( S+ V0 P  i2 T
正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。2 j6 A2 F; k8 _" _3 T( ?
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。
( C1 |- L7 l5 R+ Y, I分析后，发现可能有以下原因：
  _+ s6 ]" R4 Z! B1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；
6 L2 Q4 G# Y' f7 i2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；9 [4 P1 D8 C  P( n3 p
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。
% C( C; ]& S% P" c6 O) }# I4、其他原因。* f& o" N! p" d, w) {
希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？
2 @+ _: t6 W3 k- \( [; m5 ?' L+ f
( p2 \( I! u4 D3 L: r补充内容 (2015-2-6 16:45):, e- c8 n+ K# A
发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

回复 宋红卫song 的帖子1 M: g" Q4 N, g

6 R, j9 o) B5 x+ y' p1 h& a从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的
* u6 P/ a" k* z5 h0 i小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧$ L8 y6 o' ]5 x# p. P6 e5 @# B6 ]
* O0 m2 M0 t' h: J
补充内容 (2015-2-10 14:05):
8 ^( \4 J5 K6 D" _" G第九天- -

宋红卫song

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6 j& h( x' V. o0 B5 |" J: i, [4 I
嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

回复 saifast00 的帖子/ X1 f* ^3 H9 o* |' q3 `

& r4 Q& m8 G3 U4 w嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

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) i9 \7 M  G6 Y! R# i$ a! y& G0 Q, E- [( o8 f% p
嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子
4 }  Y* Y- M: w; J$ S9 z, C% K5 x3 v+ `; o" G6 d3 {4 {& v
支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教