|
- 积分
- 17
- 威望
- 17
- 包包
- 89
|
准备工作：9 v/ | L) R, c
DF12 加入0.1%BSA，100ml,取10ml冰浴，40ml放入孵箱；其余的放入4度；/ C& S: K/ v& I
DNase I 100*; PI：50ug/ml; Hoechst33342: 1000ug/ml（all from Sigma）9 D9 {4 R* D+ u7 b
计数板，冰盒；各种离心管，无菌流式管（BD），400滤网（BD）
; o' i Y7 |2 a2 {2 b* M- f+ _# \ r
染色方案：
0 k8 v I7 t% o e# n2 W6 V- S6 B① 细胞染色：
1 f1 F4 I) S" _- e# a细胞消化计数，用DF12重悬，调整到1×106/ml浓度，分成三组2管；' K, |8 z7 @3 V' k1 {
37℃DF12洗涤，制备成单细胞悬液；# n- e5 y3 q- w
两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6 ug/ml，其中CON组再加入维拉帕米，终浓度50 umol/ml；& x& w. _4 P7 G% M
37℃避光水浴90 min；9 w& E+ g* U/ i) z) S
冰上10 min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1×107/ml以上，必要时加入1倍的DNase I；
. G. D+ ?2 N3 p& E. c& x! F( e. g上机前再加入PI使终浓度为2 ug/ml. 并且400滤网过滤细胞
! W. N+ {/ i8 L! u; W& z7 {②流式细胞仪检测：
# ^ w, c6 n: D6 m' X9 _. N355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比. 分选出SP细胞及Non SP细胞.9 J; L }, F. P* o
5 v9 F s2 V% u5 H, K! U
/ @- z# q( g/ p! h" e# Xgoodell的sp分选- A4 A/ A$ M& O# q$ e: {6 ?
http://sciencepark.mdanderson.org/fcores/flow/files/SP.pdf：# V& B# n1 L3 W- D/ C" c/ l
Hoechst 33342 Cell Staining and Side Population Purification Protocol; [% _) |! Q; S/ r
(see Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806)% U! c' i' g: ]6 F
The ability to discriminate Hoechst SP cells is based on the differential efflux of Hoechst' d! C% h+ o7 d
33342 by a multi-drug-like transporter. This is an active biological process. Therefore,
* @, q% W0 ? Y$ p6 S' Roptimal resolution of the profile is obtained with great attention to staining conditions.! p; F7 O8 W& @* `6 Q7 z
The Hoechst concentration, staining time, and staining temperature are all CRITICAL.
9 i: L2 H! y3 A' i( dLikewise, when the staining process is over, the cells should be maintained at 4°C in
, `; _% P, }: Q' Worder to prohibit further dye efflux.
- I+ J" u; ~' k3 M1 y/ o1) Ensure that a water bath is precisely at 37°C. The medium needs to be prewarmed
1 `& n: ~3 z2 [, a; Sbeforehand.
4 Q4 y6 i4 } G. }: B; W2) To thaw cells from the cryovials, put them directly from dry ice into the 37°C
- T) L* i% D( I5 _water bath. Once the cells are thawed, wash them once by transfering them to a' M* u( x8 E/ ~
centrifuge tube, adding 9 mls of their respective media, and spinning for 59 M( x: u8 j: i6 K @
minutes at 1200 rpm in order to remove the cryo-preservants.
0 x8 E5 Q# } I& [ c7 E! g3) Resuspend at 106 cells per ml in pre-warmed DMEM+5% FBS. Mix well." x/ d9 ~" A0 c5 E% \
4) Add Hoechst to a final concentration of 5 µg/ml (a 200x dilution of the stock).
8 \+ j, l4 C& o2 J) C* ^# V& A5) Mix the cells well, and place in the 37°C water bath for 90 minutes exactly. Make
. \, p2 R) P- w+ L1 ]8 ?; hsure the staining tubes are well submerged in the bath water to ensure that the. d/ t8 G8 a1 l
temperature of the cells is maintained at 37°C. Tubes should be mixed several
G- D; ~9 F- [; I" Ctimes during incubation.
M% u, d0 j% K4 b/ o6) After 90 minutes, spin the cells down in the COLD and resuspend in COLD
5 P5 }6 X E4 k( q" {Phosphate Buffered Saline (PBS).2 y2 D: Y. Y0 \% Z+ k
7) All further proceedings should be carried out at 4°C to prohibit leakage of the& N. U; O% F# w2 t. n9 y
Hoechst dye. Add 2 µg/ml of 7-AAD to the suspended cells (a 100X dilution of
6 T+ y/ F0 A t9 R2 Wthe stock provided) and mix about 5 minutes before FACS analysis. This will7 i! q1 G8 [3 K' s7 J7 {0 p- M
allow for the discrimination of dead versus live cells as 7-AAD permeates only' k) m8 b4 q( f M: }
cells that do not have an intact membrane.4 w. ^! ^2 L x- D# h
: O! O% y6 G2 ]6 S+ z& _' ?; \8 e
" P- Z/ z) G) w( z9 Z' ~5 @$ v$ T: a: y: z/ @, i1 d
这是我收集的SP分选的方法：与大家共享。3 C |$ c3 l4 a& M7 ]
一 Hoechst染色方案8 _6 z4 I3 X8 Z- E
1. 在37℃循环水浴箱中预热DMEM+培养基。确保温度为37℃。8 V+ j2 |1 @7 Y \ S3 b% @
2. 重悬细胞于预热的DMEM+培养基中，浓度为106/ml，为了避免细胞留在试管中，所以在Hoechst染色时必须用聚丙烯试管。当要染大量细胞时，在250ml聚丙烯试管中最为便利。2 B0 N1 |4 g) D- g% C1 y2 T
3 加入Hoechst至终浓度为5μg/ml。我们建议用200 的原液(1 mg/ml)，它是将一整瓶Hoechst粉末溶于水中(B2261, Sigma)，再分装，保存浓缩的Hoechst溶液在－20℃# a* p$ d4 P2 W% _
4 将细胞在37℃循环水浴箱中预热，在90 min 的孵育中定期混匀试管。时间和温度对于Hoechst染色来说特别关键，所以DMEM必须预热而且试管必须完全没于水面。
; p8 S& k; \( N1 n$ z0 C# G5 Hoechst染色完成后，细胞必须处于4℃以防止Hoechst继续外排, 绝不能加有Ficoll或其他别的延长高温的程序，因为这些可以导致非干细胞的其他细胞的染料外排，最终导致真正SP细胞的纯度降低。细胞4℃离心，并重悬于冰的HBSS+。
2 P3 A2 d& l4 V* d6 抗体的染色这时可以在冰上进行。为了保证干细胞的纯度，加入干细胞特异性抗体，其浓度取决于参考各自的滴度，或厂家提供的说明书。所有的染色和离心必须是4℃。
/ t( {- L( f7 R9 G; m9 A4 b3 r7 当用FACS分析细胞时，重悬细胞于冰的HBSS+，同时加入 2μg/ml PI 以区分死细胞，尽管PI染色在ＳＰ并不完全需要，但还是强力推荐。Hoechst对有些细胞有毒，PI可以分出死细胞，使Hoechst发散图更简化。9 U- H) y# Y$ n$ o) j' f
8 试剂4 F# {( [4 v, U& ]; y. w
DMEM+ ：高糖DMEM (Cat No. 11965‐092, Gibco Invitrogen)* m3 b3 i3 g( W8 V8 u
Penicillin/streptomycin (Cat No.15140‐122, Gibco Invitrogen)
7 M0 w9 | s M7 ~10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)
/ t* l1 j6 ]' q' `2% Fetal bovine serum/fetal calf serum9 K' T1 R/ a8 b% W
HBSS+ ：Hank’s平衡盐溶液(Cat. No. 14170‐112, Gibco Invitrogen)+ y; p* k! Y3 ?) q% C7 N1 |
10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)
- D1 i7 Z E( |( v. J/ V" r. v, {0 I2% Fetal bovine serum/fetal calf serum
" T1 E0 M8 u+ \7 sHoechst 33342粉 (Cat. No. B2261, Sigma)：200×原液(1 mg/ml) 的制备，将Hoechst 33342粉溶于过滤除菌的蒸馏水中 ，Sigma公司的Hoechst 33342粉刚好可以得到500ml溶液，强力推荐一次性将Hoechst 33342粉立即溶解，然后用每ml分装冻存。冻融的Hoechst份尽量少的再冻，以免使水分增加。
+ C- @+ @6 n% H, p( N7 |（PI）Propidium iodide (Cat. No. P‐4170, Sigma):工作浓度为100×（200μg/ml）溶于ＰＢＳ，并用铝箔纸遮蔽，重悬于HBSS+终浓度为2μg/ml。
; j- j( e) E. v, q; S0 F' g% @1 @; O0 |1 s; I' x! Y
二 Hoechst－染色细胞的抗体染色法和磁珠浓缩法方案
8 m. _! u$ R* ~; N5 ~１Hoechst染色结束后，重悬细胞于１×108 cells/ml 冰的HBSS+，在冰上将生物素酰化的抗体与细胞共孵育10min。（抗体的稀释剂滴度按说明书进行）9 h, O) H1 {! W4 i. G! v1 Q, ^
2 用10倍体积的HBSS+洗去未结合的抗体，在低温离心机中离心。' ~9 B% v4 J0 c; U
3 用磁珠小体标记细胞，从Miltenyi Biotech (Cat. No. 130‐090‐485)得到抗生物素磁珠小体。将细胞与20% 体积的磁珠小体在4℃条件下共孵育15min。我们发现，如果在冰上孵育，则磁珠与抗体标记细胞的效力会下降。还是在4℃冰箱中孵育较好。
& q$ B& _- S, M6 i4 a# {, H' ]4 用10倍体积的HBSS+冲洗细胞，在低温离心机中离心。/ o( ?( F. E0 ?; O M& u e; L/ v
5 重悬细胞于2×108 cells/ml于冰的HBSS+，细胞调整至流式细胞仪分析所需的容器。
s6 N7 Q- e3 O三 Hoechst SP细胞的流式细胞仪分析
% x( ] G( ]: m9 d" ^8 A7 x1 Hoechst 33342的激发：要观察到ＳＰ，必须用紫外激光器来激发Hoechst 33342 染料和PI。紫外激光也会有较好的效果(Simpson et al., 2006)。Hoechst在350 nm波长被激发，另外的激光如激发FITC 和PE 的488激光可以用来激发其他的荧光染料。) \9 y6 G2 f* V9 g' s) S r
２ Hoechst发散的探测：Hoechst染料的发散用两个探测器来测量：Hoechst Blue和 Hoechst Red。Hoechst Blue用450/20滤光片测量，Hoechst Red用675LP滤光片测量。用一种分色镜（我们用610 DMSP）来分离发散波长，PI荧光亦用675LP通道来测量。但他的阳性信号要较Hoechst Red信号更亮。可以用488激光同时激发和发散PI，用来将死细胞从发红色荧光的活的Hoechst染色的细胞中分离出来。同时，别的滤光片也可以应用，但这里推荐的是做好的。% z* z+ |6 f, {. a- _: b; ~% d c
还有，一种高能的紫外激光(50–100 mW)可以最好的分选SP。低能也许够用，但群不一定很清楚。最关键的是，SP可以被其阻断剂—维拉帕米，一种抗体共染，特异性的针对SP鉴定。
; V3 a" o$ i; \! Q4 f3 流式细胞仪分析：Hoechst荧光显示为Hoechst BLUE 对 RED散点，BLUE在Y轴，RED在X轴，都是线性，电压调整后，红细胞在左下角，PI染色+的死细胞Y轴的极右端，多数细胞在中心位置，或右上方。也有可能检测到一大部分 G0–G1及 S–G2–M cells 在右上方。8 ^! p4 D7 O1 w% ^6 {; u8 j% q5 Q. t
为了能看到SP细胞，画一个取样门将红细胞和死细胞排除，一个未浓缩的骨髓细胞样本，取样门可以有50,000–100,000细胞需要SP鉴定。SP区要像图示来画。对于一个未浓缩的鼠骨髓标本来讲，SP细胞的数量大约为0.01%–0.05%，SP细胞在正常的鼠骨髓细胞显著的大于这个‐0.05%提示Hoechst的弱染色而受非SP的污染。这完全可以想象，SP细胞中有一些细胞不表达经典的造血干细胞表面标志。如果染色进行的适当，SP细胞的65 —95% 会有经典的造血干细胞表面标志，这些可以用来纯化侧群细胞。
{& y6 O% @7 S+ K4 操作FACS的要点：Hoechst的发散是呈线性的，好的CVs对于SP鉴定至关重要。要保持好的CVs，重要的就是要用能紧密地分布线性样式的颗粒 (DNA check beads, Coulter)来校准。另外，低的样本分压同样重要。最大的样本分压不能快于用校准颗粒校准的定标。骨髓细胞可以较高浓度来分析，以保持低样本分压。 ~. Z; U, ]0 C1 p
5 好的SP染色的证实
8 [' i) |) J ?# h( J% C, Y（1） 共孵育维拉帕米处理过的对照来确保SP 可被清除。在Hoechs染色的整个过程中加入终浓度为50μM的维拉帕米，经维拉帕米处理后，SP细胞可以被阻滞。
$ s$ t- L1 L) {% u7 M) i+ Z# J5 D( w（2） 用抗体共染色：SP细胞里富含干细胞，好的Hoechst染色中60%–80%的SP细胞为干细胞表面标志物阳性细胞。 |
|
发表于 2009-3-20 10:44
发表于 2012-7-5 23:33
发表于 2009-12-16 00:42
