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发表于 2009-3-20 10:44 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

准备工作：
DF12 加入0.1%BSA，100ml,取10ml冰浴，40ml放入孵箱；其余的放入4度；
DNase I 100*; PI：50ug/ml; Hoechst33342: 1000ug/ml（all from Sigma）* A1 ?# \! X" P+ v4 a( ?( q
计数板，冰盒；各种离心管，无菌流式管（BD），400滤网（BD）+ O  t5 k. u+ g9 _* R2 S* Z
' Z. r6 P2 ~0 ?1 e) l  \
染色方案：9 |3 g2 h! ]3 @
① 细胞染色：
细胞消化计数，用DF12重悬，调整到1×106/ml浓度，分成三组2管；. R% J# b5 O. M. w* R
37℃DF12洗涤，制备成单细胞悬液；
两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6 ug/ml，其中CON组再加入维拉帕米，终浓度50 umol/ml；
37℃避光水浴90 min；  Q3 @/ u* P- e, X5 }0 \: e# a  U
冰上10 min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1×107/ml以上，必要时加入1倍的DNase I；
上机前再加入PI使终浓度为2 ug/ml. 并且400滤网过滤细胞
②流式细胞仪检测：
355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比. 分选出SP细胞及Non SP细胞.7 }+ Q, ^+ x1 Y8 C3 ?/ Z
& ^" r1 g8 C2 l1 z2 l

goodell的sp分选: d  h$ ?. ]! F, ]+ j9 t7 ^
http://sciencepark.mdanderson.org/fcores/flow/files/SP.pdf：7 g0 L  ?$ Y; u8 J
Hoechst 33342 Cell Staining and Side Population Purification Protocol
(see Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806)8 Y- n; e. o. C. O# U' j7 z; N
The ability to discriminate Hoechst SP cells is based on the differential efflux of Hoechst% m" e" n+ F; u& I* G8 g1 G4 ?* \
33342 by a multi-drug-like transporter. This is an active biological process. Therefore,
optimal resolution of the profile is obtained with great attention to staining conditions.
The Hoechst concentration, staining time, and staining temperature are all CRITICAL.8 K$ t0 o& Z9 r# G$ W7 A4 \
Likewise, when the staining process is over, the cells should be maintained at 4°C in# c/ W4 `$ e& y- W: [% y  i
order to prohibit further dye efflux.
1) Ensure that a water bath is precisely at 37°C. The medium needs to be prewarmed1 [% w" T. G4 \- R4 p6 ]% Y2 p8 T
beforehand.
2) To thaw cells from the cryovials, put them directly from dry ice into the 37°C* p, ^; B8 V! C$ |! n$ ]2 j: ]
water bath. Once the cells are thawed, wash them once by transfering them to a: r+ r( a1 O2 l" G) m; w
centrifuge tube, adding 9 mls of their respective media, and spinning for 5
minutes at 1200 rpm in order to remove the cryo-preservants.
3) Resuspend at 106 cells per ml in pre-warmed DMEM+5% FBS. Mix well.
4) Add Hoechst to a final concentration of 5 µg/ml (a 200x dilution of the stock).
5) Mix the cells well, and place in the 37°C water bath for 90 minutes exactly. Make1 o# u; b7 f3 Y" X6 l3 f" V
sure the staining tubes are well submerged in the bath water to ensure that the9 T  u. Y* L5 Y% s6 G0 o4 j5 w8 v/ {
temperature of the cells is maintained at 37°C. Tubes should be mixed several
times during incubation.
6) After 90 minutes, spin the cells down in the COLD and resuspend in COLD
Phosphate Buffered Saline (PBS).6 {5 Q4 h4 j% [0 U3 T
7) All further proceedings should be carried out at 4°C to prohibit leakage of the0 u( r! k$ X# |  Y$ F
Hoechst dye. Add 2 µg/ml of 7-AAD to the suspended cells (a 100X dilution of
the stock provided) and mix about 5 minutes before FACS analysis. This will, C' C0 ]2 X# y
allow for the discrimination of dead versus live cells as 7-AAD permeates only5 {( g: g4 y( a; Y0 K
cells that do not have an intact membrane.+ W! }/ a4 @) T0 I: X% v

8 |% j% G# Y8 _

这是我收集的SP分选的方法：与大家共享。: ~  Q# Z+ K7 C$ n; Q1 Z/ u/ Z5 l+ G
一 Hoechst染色方案( x4 j) s  q; a. C
1. 在37℃循环水浴箱中预热DMEM+培养基。确保温度为37℃。
2. 重悬细胞于预热的DMEM+培养基中，浓度为106/ml，为了避免细胞留在试管中，所以在Hoechst染色时必须用聚丙烯试管。当要染大量细胞时，在250ml聚丙烯试管中最为便利。! y& D- u( H/ x: H6 v
3 加入Hoechst至终浓度为5μg/ml。我们建议用200 的原液(1 mg/ml)，它是将一整瓶Hoechst粉末溶于水中(B2261, Sigma)，再分装，保存浓缩的Hoechst溶液在－20℃
4 将细胞在37℃循环水浴箱中预热，在90 min 的孵育中定期混匀试管。时间和温度对于Hoechst染色来说特别关键，所以DMEM必须预热而且试管必须完全没于水面。, p. r0 v1 n. l; Z: q, D
5 Hoechst染色完成后，细胞必须处于4℃以防止Hoechst继续外排, 绝不能加有Ficoll或其他别的延长高温的程序，因为这些可以导致非干细胞的其他细胞的染料外排，最终导致真正SP细胞的纯度降低。细胞4℃离心，并重悬于冰的HBSS+。
6 抗体的染色这时可以在冰上进行。为了保证干细胞的纯度，加入干细胞特异性抗体，其浓度取决于参考各自的滴度，或厂家提供的说明书。所有的染色和离心必须是4℃。
7 当用FACS分析细胞时，重悬细胞于冰的HBSS+，同时加入 2μg/ml PI 以区分死细胞，尽管PI染色在ＳＰ并不完全需要，但还是强力推荐。Hoechst对有些细胞有毒，PI可以分出死细胞，使Hoechst发散图更简化。
8 试剂, z- h6 k) r- Z3 {7 R3 h% C
DMEM+ ：高糖DMEM (Cat No. 11965‐092, Gibco Invitrogen). `) d% z, C' V( [
Penicillin/streptomycin (Cat No.15140‐122, Gibco Invitrogen)
10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum$ v1 X% c7 Y. `9 I% v
HBSS+ ：Hank’s平衡盐溶液(Cat. No. 14170‐112, Gibco Invitrogen)
10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum, B# J0 M/ |1 }8 m2 F
Hoechst 33342粉 (Cat. No. B2261, Sigma)：200×原液(1 mg/ml) 的制备，将Hoechst 33342粉溶于过滤除菌的蒸馏水中，Sigma公司的Hoechst 33342粉刚好可以得到500ml溶液，强力推荐一次性将Hoechst 33342粉立即溶解，然后用每ml分装冻存。冻融的Hoechst份尽量少的再冻，以免使水分增加。 2 O7 x4 Y+ E4 k* n7 F7 `% ]) A+ ?
（PI）Propidium iodide (Cat. No. P‐4170, Sigma):工作浓度为100×（200μg/ml）溶于ＰＢＳ，并用铝箔纸遮蔽，重悬于HBSS+终浓度为2μg/ml。

二 Hoechst－染色细胞的抗体染色法和磁珠浓缩法方案
１Hoechst染色结束后，重悬细胞于１×108 cells/ml　冰的HBSS+，在冰上将生物素酰化的抗体与细胞共孵育10min。（抗体的稀释剂滴度按说明书进行）
2 用10倍体积的HBSS+洗去未结合的抗体，在低温离心机中离心。8 C) P( \( T5 s/ M, \4 V% Y; O7 q
3 用磁珠小体标记细胞，从Miltenyi Biotech (Cat. No. 130‐090‐485)得到抗生物素磁珠小体。将细胞与20% 体积的磁珠小体在4℃条件下共孵育15min。我们发现，如果在冰上孵育，则磁珠与抗体标记细胞的效力会下降。还是在4℃冰箱中孵育较好。
4 用10倍体积的HBSS+冲洗细胞，在低温离心机中离心。5 ]3 z8 C* u" a: a2 k
5 重悬细胞于2×108 cells/ml于冰的HBSS+，细胞调整至流式细胞仪分析所需的容器。
三 Hoechst SP细胞的流式细胞仪分析
1 Hoechst 33342的激发：要观察到ＳＰ，必须用紫外激光器来激发Hoechst 33342 染料和PI。紫外激光也会有较好的效果(Simpson et al., 2006)。Hoechst在350 nm波长被激发，另外的激光如激发FITC 和PE 的488激光可以用来激发其他的荧光染料。& k7 z+ z0 E% `
２ Hoechst发散的探测：Hoechst染料的发散用两个探测器来测量：Hoechst Blue和 Hoechst Red。Hoechst Blue用450/20滤光片测量，Hoechst Red用675LP滤光片测量。用一种分色镜（我们用610 DMSP）来分离发散波长，PI荧光亦用675LP通道来测量。但他的阳性信号要较Hoechst Red信号更亮。可以用488激光同时激发和发散PI，用来将死细胞从发红色荧光的活的Hoechst染色的细胞中分离出来。同时，别的滤光片也可以应用，但这里推荐的是做好的。
还有，一种高能的紫外激光(50–100 mW)可以最好的分选SP。低能也许够用，但群不一定很清楚。最关键的是，SP可以被其阻断剂—维拉帕米，一种抗体共染，特异性的针对SP鉴定。* B1 K: M- v& @+ D: n
3 流式细胞仪分析：Hoechst荧光显示为Hoechst BLUE 对 RED散点，BLUE在Y轴，RED在X轴，都是线性，电压调整后，红细胞在左下角，PI染色+的死细胞Y轴的极右端，多数细胞在中心位置，或右上方。也有可能检测到一大部分 G0–G1及 S–G2–M cells 在右上方。
为了能看到SP细胞，画一个取样门将红细胞和死细胞排除，一个未浓缩的骨髓细胞样本，取样门可以有50,000–100,000细胞需要SP鉴定。SP区要像图示来画。对于一个未浓缩的鼠骨髓标本来讲，SP细胞的数量大约为0.01%–0.05%，SP细胞在正常的鼠骨髓细胞显著的大于这个‐0.05%提示Hoechst的弱染色而受非SP的污染。这完全可以想象，SP细胞中有一些细胞不表达经典的造血干细胞表面标志。如果染色进行的适当，SP细胞的65 —95% 会有经典的造血干细胞表面标志，这些可以用来纯化侧群细胞。
4 操作FACS的要点：Hoechst的发散是呈线性的，好的CVs对于SP鉴定至关重要。要保持好的CVs，重要的就是要用能紧密地分布线性样式的颗粒 (DNA check beads, Coulter)来校准。另外，低的样本分压同样重要。最大的样本分压不能快于用校准颗粒校准的定标。骨髓细胞可以较高浓度来分析，以保持低样本分压。2 P! s" G- i- n
5 好的SP染色的证实. t6 T2 g+ R2 P: B+ Z+ |
（1）共孵育维拉帕米处理过的对照来确保SP 可被清除。在Hoechs染色的整个过程中加入终浓度为50μM的维拉帕米，经维拉帕米处理后，SP细胞可以被阻滞。& N: U7 T$ \2 ]5 @) x, @3 `5 l
（2）用抗体共染色：SP细胞里富含干细胞，好的Hoechst染色中60%–80%的SP细胞为干细胞表面标志物阳性细胞。

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