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sunny

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发表于 2009-3-20 10:44 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

准备工作：
DF12 加入0.1%BSA，100ml,取10ml冰浴，40ml放入孵箱；其余的放入4度；, ]2 d* I5 L1 V$ B' r" E
DNase I 100*; PI：50ug/ml; Hoechst33342: 1000ug/ml（all from Sigma）3 j1 z! P7 c' ^
计数板，冰盒；各种离心管，无菌流式管（BD），400滤网（BD）9 y# _' {" b. V) G/ @
; n( e2 A* d9 p  N- Z
染色方案：
① 细胞染色：
细胞消化计数，用DF12重悬，调整到1×106/ml浓度，分成三组2管；) Q/ G: B8 [# T; h
37℃DF12洗涤，制备成单细胞悬液；
两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6 ug/ml，其中CON组再加入维拉帕米，终浓度50 umol/ml；
37℃避光水浴90 min；$ L. M6 m  E- U  t& k  K& X4 a3 i
冰上10 min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1×107/ml以上，必要时加入1倍的DNase I；
上机前再加入PI使终浓度为2 ug/ml. 并且400滤网过滤细胞
②流式细胞仪检测：
355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比. 分选出SP细胞及Non SP细胞.% O  Z( p( E# ^1 `

goodell的sp分选; E- N; F6 e/ u9 w7 u6 \
http://sciencepark.mdanderson.org/fcores/flow/files/SP.pdf：
Hoechst 33342 Cell Staining and Side Population Purification Protocol# Y" M: D$ |8 n' p1 o
(see Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806)) K2 s' G- F" P2 \( ^
The ability to discriminate Hoechst SP cells is based on the differential efflux of Hoechst
33342 by a multi-drug-like transporter. This is an active biological process. Therefore,
optimal resolution of the profile is obtained with great attention to staining conditions." F; t2 I1 i# t4 g
The Hoechst concentration, staining time, and staining temperature are all CRITICAL.& v" G) R' l! l8 e) l) F* k$ e' r
Likewise, when the staining process is over, the cells should be maintained at 4°C in3 j- y. w1 w/ {+ C; O3 m6 ~! L
order to prohibit further dye efflux.
1) Ensure that a water bath is precisely at 37°C. The medium needs to be prewarmed
beforehand.
2) To thaw cells from the cryovials, put them directly from dry ice into the 37°C
water bath. Once the cells are thawed, wash them once by transfering them to a" j) m8 ?. Q1 L2 a- }- O5 e
centrifuge tube, adding 9 mls of their respective media, and spinning for 5
minutes at 1200 rpm in order to remove the cryo-preservants.
3) Resuspend at 106 cells per ml in pre-warmed DMEM+5% FBS. Mix well., h  E9 d% g8 ]. H! Y: m+ J+ Z
4) Add Hoechst to a final concentration of 5 µg/ml (a 200x dilution of the stock).
5) Mix the cells well, and place in the 37°C water bath for 90 minutes exactly. Make
sure the staining tubes are well submerged in the bath water to ensure that the
temperature of the cells is maintained at 37°C. Tubes should be mixed several! k2 [) m/ d$ Q# _# y; u" @' Q
times during incubation.  ?- I; g4 i% w% J0 b! y4 M+ {; C
6) After 90 minutes, spin the cells down in the COLD and resuspend in COLD
Phosphate Buffered Saline (PBS).
7) All further proceedings should be carried out at 4°C to prohibit leakage of the8 Q8 M$ q7 W3 v0 r
Hoechst dye. Add 2 µg/ml of 7-AAD to the suspended cells (a 100X dilution of, q0 E' F& T# w% H2 }
the stock provided) and mix about 5 minutes before FACS analysis. This will  f" Q! d, M/ @' Q6 G) w8 N
allow for the discrimination of dead versus live cells as 7-AAD permeates only8 W; F) M: K" X. B1 e
cells that do not have an intact membrane.

! f& R% n1 U2 t/ g6 o4 X. O
这是我收集的SP分选的方法：与大家共享。- u; }, p# N5 o4 g, }1 G" a4 q# o( A
一 Hoechst染色方案( H" O3 E/ @% {5 c, r( q
1. 在37℃循环水浴箱中预热DMEM+培养基。确保温度为37℃。8 W* c! l' |* X- f; z2 |& q9 k
2. 重悬细胞于预热的DMEM+培养基中，浓度为106/ml，为了避免细胞留在试管中，所以在Hoechst染色时必须用聚丙烯试管。当要染大量细胞时，在250ml聚丙烯试管中最为便利。8 Y% t( q) h0 L; S3 s
3 加入Hoechst至终浓度为5μg/ml。我们建议用200 的原液(1 mg/ml)，它是将一整瓶Hoechst粉末溶于水中(B2261, Sigma)，再分装，保存浓缩的Hoechst溶液在－20℃
4 将细胞在37℃循环水浴箱中预热，在90 min 的孵育中定期混匀试管。时间和温度对于Hoechst染色来说特别关键，所以DMEM必须预热而且试管必须完全没于水面。
5 Hoechst染色完成后，细胞必须处于4℃以防止Hoechst继续外排, 绝不能加有Ficoll或其他别的延长高温的程序，因为这些可以导致非干细胞的其他细胞的染料外排，最终导致真正SP细胞的纯度降低。细胞4℃离心，并重悬于冰的HBSS+。% E. }9 u0 h- I* @9 D4 {: O; a
6 抗体的染色这时可以在冰上进行。为了保证干细胞的纯度，加入干细胞特异性抗体，其浓度取决于参考各自的滴度，或厂家提供的说明书。所有的染色和离心必须是4℃。
7 当用FACS分析细胞时，重悬细胞于冰的HBSS+，同时加入 2μg/ml PI 以区分死细胞，尽管PI染色在ＳＰ并不完全需要，但还是强力推荐。Hoechst对有些细胞有毒，PI可以分出死细胞，使Hoechst发散图更简化。
8 试剂
DMEM+ ：高糖DMEM (Cat No. 11965‐092, Gibco Invitrogen)0 C1 V  v. i0 a1 n
Penicillin/streptomycin (Cat No.15140‐122, Gibco Invitrogen)
10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)) u% }9 l" s0 e0 Q8 P' M& _
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum
HBSS+ ：Hank’s平衡盐溶液(Cat. No. 14170‐112, Gibco Invitrogen)8 W: A7 U" ?  }+ H% Q
10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)9 H7 Z  g7 R3 c! J$ q
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum, o9 q& u1 c2 M. E; F# D% h
Hoechst 33342粉 (Cat. No. B2261, Sigma)：200×原液(1 mg/ml) 的制备，将Hoechst 33342粉溶于过滤除菌的蒸馏水中，Sigma公司的Hoechst 33342粉刚好可以得到500ml溶液，强力推荐一次性将Hoechst 33342粉立即溶解，然后用每ml分装冻存。冻融的Hoechst份尽量少的再冻，以免使水分增加。
（PI）Propidium iodide (Cat. No. P‐4170, Sigma):工作浓度为100×（200μg/ml）溶于ＰＢＳ，并用铝箔纸遮蔽，重悬于HBSS+终浓度为2μg/ml。
) T) c: V7 g" H, B1 Z
二 Hoechst－染色细胞的抗体染色法和磁珠浓缩法方案
１Hoechst染色结束后，重悬细胞于１×108 cells/ml　冰的HBSS+，在冰上将生物素酰化的抗体与细胞共孵育10min。（抗体的稀释剂滴度按说明书进行）5 }6 P3 T' Q$ p2 `. \
2 用10倍体积的HBSS+洗去未结合的抗体，在低温离心机中离心。
3 用磁珠小体标记细胞，从Miltenyi Biotech (Cat. No. 130‐090‐485)得到抗生物素磁珠小体。将细胞与20% 体积的磁珠小体在4℃条件下共孵育15min。我们发现，如果在冰上孵育，则磁珠与抗体标记细胞的效力会下降。还是在4℃冰箱中孵育较好。( q0 M1 V3 \2 X/ `. Y
4 用10倍体积的HBSS+冲洗细胞，在低温离心机中离心。
5 重悬细胞于2×108 cells/ml于冰的HBSS+，细胞调整至流式细胞仪分析所需的容器。
三 Hoechst SP细胞的流式细胞仪分析
1 Hoechst 33342的激发：要观察到ＳＰ，必须用紫外激光器来激发Hoechst 33342 染料和PI。紫外激光也会有较好的效果(Simpson et al., 2006)。Hoechst在350 nm波长被激发，另外的激光如激发FITC 和PE 的488激光可以用来激发其他的荧光染料。6 e* [  G% h, f* U7 X0 t8 I+ G
２ Hoechst发散的探测：Hoechst染料的发散用两个探测器来测量：Hoechst Blue和 Hoechst Red。Hoechst Blue用450/20滤光片测量，Hoechst Red用675LP滤光片测量。用一种分色镜（我们用610 DMSP）来分离发散波长，PI荧光亦用675LP通道来测量。但他的阳性信号要较Hoechst Red信号更亮。可以用488激光同时激发和发散PI，用来将死细胞从发红色荧光的活的Hoechst染色的细胞中分离出来。同时，别的滤光片也可以应用，但这里推荐的是做好的。
还有，一种高能的紫外激光(50–100 mW)可以最好的分选SP。低能也许够用，但群不一定很清楚。最关键的是，SP可以被其阻断剂—维拉帕米，一种抗体共染，特异性的针对SP鉴定。# [) J! t7 X' q7 Y& s
3 流式细胞仪分析：Hoechst荧光显示为Hoechst BLUE 对 RED散点，BLUE在Y轴，RED在X轴，都是线性，电压调整后，红细胞在左下角，PI染色+的死细胞Y轴的极右端，多数细胞在中心位置，或右上方。也有可能检测到一大部分 G0–G1及 S–G2–M cells 在右上方。
为了能看到SP细胞，画一个取样门将红细胞和死细胞排除，一个未浓缩的骨髓细胞样本，取样门可以有50,000–100,000细胞需要SP鉴定。SP区要像图示来画。对于一个未浓缩的鼠骨髓标本来讲，SP细胞的数量大约为0.01%–0.05%，SP细胞在正常的鼠骨髓细胞显著的大于这个‐0.05%提示Hoechst的弱染色而受非SP的污染。这完全可以想象，SP细胞中有一些细胞不表达经典的造血干细胞表面标志。如果染色进行的适当，SP细胞的65 —95% 会有经典的造血干细胞表面标志，这些可以用来纯化侧群细胞。7 K2 k( _+ i1 B+ L3 k) |) w( _
4 操作FACS的要点：Hoechst的发散是呈线性的，好的CVs对于SP鉴定至关重要。要保持好的CVs，重要的就是要用能紧密地分布线性样式的颗粒 (DNA check beads, Coulter)来校准。另外，低的样本分压同样重要。最大的样本分压不能快于用校准颗粒校准的定标。骨髓细胞可以较高浓度来分析，以保持低样本分压。' |( o; e5 v7 T- O& W" u
5 好的SP染色的证实
（1）共孵育维拉帕米处理过的对照来确保SP 可被清除。在Hoechs染色的整个过程中加入终浓度为50μM的维拉帕米，经维拉帕米处理后，SP细胞可以被阻滞。
（2）用抗体共染色：SP细胞里富含干细胞，好的Hoechst染色中60%–80%的SP细胞为干细胞表面标志物阳性细胞。

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