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准备工作：
3 Q; ` i. M+ \DF12 加入0.1%BSA，100ml,取10ml冰浴，40ml放入孵箱；其余的放入4度；- A( M: O) `* ~: L
DNase I 100*; PI：50ug/ml; Hoechst33342: 1000ug/ml（all from Sigma）
3 z) ]: ?7 r# \7 y计数板，冰盒；各种离心管，无菌流式管（BD），400滤网（BD）+ }6 L9 u3 y7 E6 v0 E$ [5 k
% L7 D5 B. N* h N5 r染色方案：
0 a$ L3 h- ^* m! F# I① 细胞染色：: z* B) p+ k$ t" f( G# a6 g
细胞消化计数，用DF12重悬，调整到1×106/ml浓度，分成三组2管；3 @8 X$ l9 B6 ?4 A ^1 }
37℃DF12洗涤，制备成单细胞悬液；
+ t. q# T1 L4 r, u+ z两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6 ug/ml，其中CON组再加入维拉帕米，终浓度50 umol/ml；
1 w4 M4 T' e M+ T" K37℃避光水浴90 min；8 K& ]" G1 R. H( Q& D! I! M4 _
冰上10 min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1×107/ml以上，必要时加入1倍的DNase I；
. a s5 W' A5 v上机前再加入PI使终浓度为2 ug/ml. 并且400滤网过滤细胞1 w( r! i* ~+ N- i D6 e
②流式细胞仪检测：
* a. C/ p' y9 r+ o' p355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比. 分选出SP细胞及Non SP细胞.
# _- @9 W7 I- L. c) L Q6 m" \3 R r7 P1 ~* A3 ` d
& {, M2 ?. @1 _5 K6 Ggoodell的sp分选6 [. }: }7 A7 V' T5 T' w. F5 t
http://sciencepark.mdanderson.org/fcores/flow/files/SP.pdf：
6 C9 S0 N9 g, H# QHoechst 33342 Cell Staining and Side Population Purification Protocol
& ?/ w8 l0 E" _' }+ O2 x, F(see Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806)
& V, P! V" V7 e! z+ K. S8 S( G% m- i, {The ability to discriminate Hoechst SP cells is based on the differential efflux of Hoechst
# [9 Q0 K0 j3 E: n+ h33342 by a multi-drug-like transporter. This is an active biological process. Therefore, Z# R6 K# Z5 O& w* v) a4 h
optimal resolution of the profile is obtained with great attention to staining conditions.
9 ]1 o. ~" H( B' TThe Hoechst concentration, staining time, and staining temperature are all CRITICAL.8 E5 D2 a. N# m! g7 r! V+ Y6 b8 d6 _
Likewise, when the staining process is over, the cells should be maintained at 4°C in3 U& X- \/ ?1 M" J0 E: t! q
order to prohibit further dye efflux.% X7 h" x: F8 c0 x
1) Ensure that a water bath is precisely at 37°C. The medium needs to be prewarmed
) v/ l/ ?- i+ h. b' I2 _beforehand.
$ B- u9 ^& v) L: R2 E! N2 l2) To thaw cells from the cryovials, put them directly from dry ice into the 37°C) K& f+ d$ f N
water bath. Once the cells are thawed, wash them once by transfering them to a
* ?5 l( e; B5 E: r* G+ {centrifuge tube, adding 9 mls of their respective media, and spinning for 5
: r( I( _, k/ Mminutes at 1200 rpm in order to remove the cryo-preservants.9 t& g( e4 F' o! z8 x* N8 f, s1 N
3) Resuspend at 106 cells per ml in pre-warmed DMEM+5% FBS. Mix well.: e% E* C+ C8 l3 n7 C, ^% a4 ]5 p* }
4) Add Hoechst to a final concentration of 5 µg/ml (a 200x dilution of the stock).
, a- D& l- W9 M* F7 O( l) ~5) Mix the cells well, and place in the 37°C water bath for 90 minutes exactly. Make
8 t/ ?& p' r. d \% J3 zsure the staining tubes are well submerged in the bath water to ensure that the. _' o$ N' u1 V6 J. D6 D; A4 a
temperature of the cells is maintained at 37°C. Tubes should be mixed several; P8 c9 B) Y9 b5 M
times during incubation.) R- o2 n9 ?6 Y2 ~$ c* A
6) After 90 minutes, spin the cells down in the COLD and resuspend in COLD1 ], N" x1 Q3 A. B
Phosphate Buffered Saline (PBS).+ a) A" y6 d G) G1 G3 e
7) All further proceedings should be carried out at 4°C to prohibit leakage of the" ?5 i6 w, L) {2 e: U7 |/ k, b
Hoechst dye. Add 2 µg/ml of 7-AAD to the suspended cells (a 100X dilution of7 E" k: d* p% ?! M7 w
the stock provided) and mix about 5 minutes before FACS analysis. This will
6 u7 v. y. N: {" u0 b2 W4 Hallow for the discrimination of dead versus live cells as 7-AAD permeates only
6 ?& f9 j! B7 Fcells that do not have an intact membrane.) k5 A F$ J7 p1 Y
+ w2 ]8 C. T* C9 Q
$ X, g4 t/ l" ~# V5 S& W W1 K4 j2 X
# M8 ?9 d( E* N这是我收集的SP分选的方法：与大家共享。
; H8 \' a* Y/ `' t5 I' b一 Hoechst染色方案
; [5 R- k& ?+ b1 L9 P1. 在37℃循环水浴箱中预热DMEM+培养基。确保温度为37℃。
7 e8 ~6 ]" Q) V5 l: F9 [2. 重悬细胞于预热的DMEM+培养基中，浓度为106/ml，为了避免细胞留在试管中，所以在Hoechst染色时必须用聚丙烯试管。当要染大量细胞时，在250ml聚丙烯试管中最为便利。
. y+ l( T$ ? u+ l4 g3 加入Hoechst至终浓度为5μg/ml。我们建议用200 的原液(1 mg/ml)，它是将一整瓶Hoechst粉末溶于水中(B2261, Sigma)，再分装，保存浓缩的Hoechst溶液在－20℃7 z2 o- n- ` |. R
4 将细胞在37℃循环水浴箱中预热，在90 min 的孵育中定期混匀试管。时间和温度对于Hoechst染色来说特别关键，所以DMEM必须预热而且试管必须完全没于水面。
0 l) {0 ^9 h" K5 Hoechst染色完成后，细胞必须处于4℃以防止Hoechst继续外排, 绝不能加有Ficoll或其他别的延长高温的程序，因为这些可以导致非干细胞的其他细胞的染料外排，最终导致真正SP细胞的纯度降低。细胞4℃离心，并重悬于冰的HBSS+。0 y, Y; F; J! |
6 抗体的染色这时可以在冰上进行。为了保证干细胞的纯度，加入干细胞特异性抗体，其浓度取决于参考各自的滴度，或厂家提供的说明书。所有的染色和离心必须是4℃。: m! P2 _0 j B9 y2 M) u! ^, B; p/ P
7 当用FACS分析细胞时，重悬细胞于冰的HBSS+，同时加入 2μg/ml PI 以区分死细胞，尽管PI染色在ＳＰ并不完全需要，但还是强力推荐。Hoechst对有些细胞有毒，PI可以分出死细胞，使Hoechst发散图更简化。
! u: H2 G6 C. p- L8 试剂
% X% H" P$ n0 N2 A1 q* LDMEM+ ：高糖DMEM (Cat No. 11965‐092, Gibco Invitrogen)
4 @6 j0 v9 s) l: [0 z+ Y$ m1 pPenicillin/streptomycin (Cat No.15140‐122, Gibco Invitrogen)
3 z# h2 t7 ~7 ~2 t- e( I" V10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)6 y4 P; j! O% x
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum- \: j D+ R. _
HBSS+ ：Hank’s平衡盐溶液(Cat. No. 14170‐112, Gibco Invitrogen)( C3 c2 M, p$ I- B9 J; O& ?
10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)
8 D3 s% j2 A/ v0 ^4 m8 y" Q. x; Z2% Fetal bovine serum/fetal calf serum n4 P% g, _6 \" Q* d
Hoechst 33342粉 (Cat. No. B2261, Sigma)：200×原液(1 mg/ml) 的制备，将Hoechst 33342粉溶于过滤除菌的蒸馏水中 ，Sigma公司的Hoechst 33342粉刚好可以得到500ml溶液，强力推荐一次性将Hoechst 33342粉立即溶解，然后用每ml分装冻存。冻融的Hoechst份尽量少的再冻，以免使水分增加。
+ N0 Q: K- ^: g& a! Z（PI）Propidium iodide (Cat. No. P‐4170, Sigma):工作浓度为100×（200μg/ml）溶于ＰＢＳ，并用铝箔纸遮蔽，重悬于HBSS+终浓度为2μg/ml。
. @+ I- n$ l0 V& z' X! a/ q
, e& u/ w. e, v/ l二 Hoechst－染色细胞的抗体染色法和磁珠浓缩法方案3 j- b5 a" q4 [6 h! z* r* v4 D: \
１Hoechst染色结束后，重悬细胞于１×108 cells/ml 冰的HBSS+，在冰上将生物素酰化的抗体与细胞共孵育10min。（抗体的稀释剂滴度按说明书进行）" {% L& S1 d8 [( X* q0 r
2 用10倍体积的HBSS+洗去未结合的抗体，在低温离心机中离心。2 p6 D3 y6 z, w( o
3 用磁珠小体标记细胞，从Miltenyi Biotech (Cat. No. 130‐090‐485)得到抗生物素磁珠小体。将细胞与20% 体积的磁珠小体在4℃条件下共孵育15min。我们发现，如果在冰上孵育，则磁珠与抗体标记细胞的效力会下降。还是在4℃冰箱中孵育较好。5 s2 `7 u: V; j% @& {6 ~* M& X$ F0 f
4 用10倍体积的HBSS+冲洗细胞，在低温离心机中离心。
- N. k) \- U0 J: x+ u' M) b5 重悬细胞于2×108 cells/ml于冰的HBSS+，细胞调整至流式细胞仪分析所需的容器。
. s% d: W' `7 N+ w5 h( |; c三 Hoechst SP细胞的流式细胞仪分析+ {4 W$ I+ g8 B% ]
1 Hoechst 33342的激发：要观察到ＳＰ，必须用紫外激光器来激发Hoechst 33342 染料和PI。紫外激光也会有较好的效果(Simpson et al., 2006)。Hoechst在350 nm波长被激发，另外的激光如激发FITC 和PE 的488激光可以用来激发其他的荧光染料。
/ `. w/ Z* a3 o7 Q% x２ Hoechst发散的探测：Hoechst染料的发散用两个探测器来测量：Hoechst Blue和 Hoechst Red。Hoechst Blue用450/20滤光片测量，Hoechst Red用675LP滤光片测量。用一种分色镜（我们用610 DMSP）来分离发散波长，PI荧光亦用675LP通道来测量。但他的阳性信号要较Hoechst Red信号更亮。可以用488激光同时激发和发散PI，用来将死细胞从发红色荧光的活的Hoechst染色的细胞中分离出来。同时，别的滤光片也可以应用，但这里推荐的是做好的。
6 Q" I g/ t- B; K8 a: G还有，一种高能的紫外激光(50–100 mW)可以最好的分选SP。低能也许够用，但群不一定很清楚。最关键的是，SP可以被其阻断剂—维拉帕米，一种抗体共染，特异性的针对SP鉴定。
+ |1 `* q$ Y) r2 K3 流式细胞仪分析：Hoechst荧光显示为Hoechst BLUE 对 RED散点，BLUE在Y轴，RED在X轴，都是线性，电压调整后，红细胞在左下角，PI染色+的死细胞Y轴的极右端，多数细胞在中心位置，或右上方。也有可能检测到一大部分 G0–G1及 S–G2–M cells 在右上方。
% }" U h; l5 [为了能看到SP细胞，画一个取样门将红细胞和死细胞排除，一个未浓缩的骨髓细胞样本，取样门可以有50,000–100,000细胞需要SP鉴定。SP区要像图示来画。对于一个未浓缩的鼠骨髓标本来讲，SP细胞的数量大约为0.01%–0.05%，SP细胞在正常的鼠骨髓细胞显著的大于这个‐0.05%提示Hoechst的弱染色而受非SP的污染。这完全可以想象，SP细胞中有一些细胞不表达经典的造血干细胞表面标志。如果染色进行的适当，SP细胞的65 —95% 会有经典的造血干细胞表面标志，这些可以用来纯化侧群细胞。
/ q+ |$ ~+ G# l0 M" S; O4 操作FACS的要点：Hoechst的发散是呈线性的，好的CVs对于SP鉴定至关重要。要保持好的CVs，重要的就是要用能紧密地分布线性样式的颗粒 (DNA check beads, Coulter)来校准。另外，低的样本分压同样重要。最大的样本分压不能快于用校准颗粒校准的定标。骨髓细胞可以较高浓度来分析，以保持低样本分压。8 t q7 \$ Z5 |* I7 `
5 好的SP染色的证实+ H$ r v. r6 W7 O3 H! P+ o9 M
（1） 共孵育维拉帕米处理过的对照来确保SP 可被清除。在Hoechs染色的整个过程中加入终浓度为50μM的维拉帕米，经维拉帕米处理后，SP细胞可以被阻滞。7 y& g& e% W z: M
（2） 用抗体共染色：SP细胞里富含干细胞，好的Hoechst染色中60%–80%的SP细胞为干细胞表面标志物阳性细胞。 |
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发表于 2009-3-20 10:44
发表于 2009-12-16 00:42
发表于 2012-7-5 23:33
