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本帖最后由 w343989328 于 2015-3-9 11:12 编辑
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先说一下我实验的一些情况，我要从组织中分选一类细胞，两个表面抗原，一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体，杂一二抗。
5 L" J3 t" l8 ]+ U4 xA抗体来源于大鼠，连着生物素的单抗，用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗；
$ Z0 K: ^( h ?# |) O1 ]; UB抗体为兔多抗，我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。
, s0 g4 }+ e- m& ?$ v& M& w6 A学校的流式分选仪器是BD的AriaII，有358nm, 488nm, 633nm三种激发光，因此我这两个抗体只能选择488来激发。
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实验的步骤大概是这样子：组织经胰酶+DNase消化，过滤得到单细胞悬液，镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml，加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时，洗两次，敷二抗半小时，洗两次，上流式前5min加入Hoechst33342，以便在区分掉死细胞。# _0 {; R4 n3 L4 |
# }' U3 h) x# ]以下是几次重复的结果：
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r7 V4 T4 s- D+ v) f8 k首先是control组，不知道上头那坨东西是什么细胞（肯定不是死细胞，而且我抗体也不会加错），几次重复都或多或少有这么一群东西；( o. M5 b# l+ W ^8 m
其次，FITC通道勉强能有一群细胞出来，但是整个population，包括nagetive cells，都往右偏；
! ^4 d/ N7 t! Z, U% H# Q: }, D而PE通道则整个群往上走，导致我没法分出细胞群。9 n6 A7 Q9 T [$ ?
9 V& _2 l. k, @9 ~# l% l% o这次结果好很多了，单独PE通道能分出群，但是一旦加入A抗体，则整个群依然往右shift。我这里要强调的是，基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞，而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge，所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。: }# o2 {* _3 X% @* _, O" ^. {
但是呢，加入A抗体后，基本所有的细胞都会往右shift，所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧？
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3 P2 W; N1 G9 R- I5 W1 h
我重复了一次，和第二次的结果一样，细胞都是往右偏。6 i ^7 g5 _/ O" x( n
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一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久，但是减少浓度或者时间并没能改善结果。
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/ C# d$ _9 a7 B+ C6 i# G不知道有没有大神能帮忙解惑，不胜感激！ |
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发表于 2015-3-9 11:12
