分离单核细胞时，如何吸取白膜层？

lxy07

如题，请问Ficoll分离全血单核细胞时，首先，如何才能准确吸取到白膜层，其次，我们用的是国产分离液，离心后试管内没有形成明显的白膜层，白膜层和分离液层界限不明显，这种情况应该如何改善？

wanglinling

是用50ml离心管梯度的吗？白膜层应该是比较明显的，可以用1ml枪头触及分离液与上层交接处的白膜层直接吸，一般7ml左右可以完全吸干净。如果没有明显的白膜层考虑1，单核细胞数量偏少。2，梯度的时候操作不当导致分界层模糊。3，降速太快扰乱了本来界限清楚的白膜层。

wanglinling

如果是上面的某种原因导致的可以改善的方法：1，梯度液应在室温18-25°使用。2，铺梯度的时候尽量放液慢，可以倾斜离心管。3，离心结束的降速调低。

cloudycity

1.首先确定你的血样和ficoll是同一种属的吧。不同种属血样的密度不同，ficoll的密度也不同，分离效果也不一样的。( Y1 ]. O( f1 _0 _" ?( V& c
2.国产的，应该也可以，以前我都使用tbd的，效果比一些进口的还好···如果不行就换其他牌子，还有，离心的时候，一定要无阻力降速，就是把降速调低，以免降速的时候，又把血荡混了。
! a2 u  V- n6 v0 i* f, V3.你的血样来源？你的血样有多少？血样是否新鲜？是不是太稀了？不新鲜的血，有凝块也分不好，比较好的就是血加上去后，自然沉降时红细胞是像细雪一样的均匀，很漂亮的，而不要有凝块。基本上全血1：1用pbs稀释，然后50mL离心管内含15ml ficoll 再加30ml稀释过的血液，1800rpm 20min升降速都调低，应该都会很明显的。外周血会好分一点，脐血的话可以用羟乙基淀粉先沉降红细胞1-2h，然后取上清再分。  d1 l- k( O# {" U1 v9 G' Q
4.如果实在不行，你就估摸着，50ml离心管，白膜大概就在15ml刻度的位置，你把上下2.5ml刻度的液体都吸了。

lxy07

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  \, m, x0 Y( I; a6 z4 ]! ^* ?; Q. T5 i2 b- [
是50ml离心管，降速已经调低了。

wanglinling

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3 Q3 o1 Q. J/ v4 h% H3 P
5 V0 \- v* g; l2 U5 o4 _3 V那你应该观察一下刚铺好梯度的时候分层是否明显，可以看出你铺的好不好

lxy07

回复 cloudycity 的帖子& S. G' t3 [& M7 M* N6 ?

5 |; ]6 X+ ]  S0 Q% X: z. E% \1 T1、是人的，Ficoll也是分离人的。7 X5 y2 O7 o! m9 `) L; g% d5 U" w
2、我们用的也是TBD的，降速已经调低了。
9 M* A; H5 J4 j5 G1 E; i( Z3、脐血，75ml，血样算新鲜的，没有凝块。
& E. h9 t) q% z4、我看有的帖子上说，取白膜层的时候要蹲着平视离心管操作，这样做是不是能更好的吸到白膜层。

lxy07

回复 wanglinling 的帖子" V# H$ ]2 |0 Y+ _( z% B
, `2 m" u- E$ G  Q
你是说血加上去以后吗？刚铺好不久后，就像cloudycity说的，血自然沉降像细雪一样降下来，但没有看到分层啊。

维维睡啦

1、先检查一下你们的FICOLL是否为MNC专用，其密度是否符合标准,为1.077±0.001。% p9 a; L. W" s+ h
2、全血加FICOLL之前要去血浆，稀释的。  ?* b8 {7 ^; l" P) A/ ^
3、加FICOLL时要小心仔细，使FICOLL和血细胞有明显分层。! O1 H" u: s0 Q$ ^! `5 |& D6 {
4、FICOLL离心时，升降速都要调低，一般为升6降4就可以。2 h+ P% x3 _" [
5、离心后即使没有明显白膜层，也会有明显的三个分层，上层为生理盐水和血浆混合，中层FICOLL层，下层血细胞。白膜层就在中层FICOLL层中，即使没有明显分层，绝大多数单个核细胞也是在这一层中，如果没有明显分层，可以把这一层液体全部吸出来，再离心获取单个核细胞。6 L0 _1 p* Y1 m! q1 b

lxy07

回复 维维睡啦 的帖子- r( ?  Q/ I+ {# t/ G
* L# b5 G9 z) g4 Y' C# i
1、Ficoll是MNC专用，密度是1.077。0 S! a) x6 e9 o2 i2 A; t5 z3 I
2、去血浆，稀释了。
# A: C: u4 T/ }2 S, w3、FICOLL和血细胞有明显分层。
  E9 q6 q8 ]/ ~& Z) @4 M2 n4、升降速调低了。
# N+ _/ A5 V3 v/ ]: G$ u1 q5、离心后有明显的三层，如果将中间层的液体全部吸出来，会使混的红细胞和血小板等杂细胞较多，有的人主张白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在1公分以上，是否有必要。