分离单核细胞时，如何吸取白膜层？

lxy07

如题，请问Ficoll分离全血单核细胞时，首先，如何才能准确吸取到白膜层，其次，我们用的是国产分离液，离心后试管内没有形成明显的白膜层，白膜层和分离液层界限不明显，这种情况应该如何改善？

wanglinling

是用50ml离心管梯度的吗？白膜层应该是比较明显的，可以用1ml枪头触及分离液与上层交接处的白膜层直接吸，一般7ml左右可以完全吸干净。如果没有明显的白膜层考虑1，单核细胞数量偏少。2，梯度的时候操作不当导致分界层模糊。3，降速太快扰乱了本来界限清楚的白膜层。

wanglinling

如果是上面的某种原因导致的可以改善的方法：1，梯度液应在室温18-25°使用。2，铺梯度的时候尽量放液慢，可以倾斜离心管。3，离心结束的降速调低。

cloudycity

1.首先确定你的血样和ficoll是同一种属的吧。不同种属血样的密度不同，ficoll的密度也不同，分离效果也不一样的。
: D1 G; B, ]- m7 z$ l  ?8 u% F, r* ^2.国产的，应该也可以，以前我都使用tbd的，效果比一些进口的还好···如果不行就换其他牌子，还有，离心的时候，一定要无阻力降速，就是把降速调低，以免降速的时候，又把血荡混了。0 l. L" i0 W! e* [
3.你的血样来源？你的血样有多少？血样是否新鲜？是不是太稀了？不新鲜的血，有凝块也分不好，比较好的就是血加上去后，自然沉降时红细胞是像细雪一样的均匀，很漂亮的，而不要有凝块。基本上全血1：1用pbs稀释，然后50mL离心管内含15ml ficoll 再加30ml稀释过的血液，1800rpm 20min升降速都调低，应该都会很明显的。外周血会好分一点，脐血的话可以用羟乙基淀粉先沉降红细胞1-2h，然后取上清再分。
# `9 D7 g+ L4 p4 m1 j4.如果实在不行，你就估摸着，50ml离心管，白膜大概就在15ml刻度的位置，你把上下2.5ml刻度的液体都吸了。

lxy07

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& a' J2 e/ y; G2 \  x
! v; W. C- H+ D& O1 L  m) t: K: w是50ml离心管，降速已经调低了。

wanglinling

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4 d7 W! g8 M1 W0 A% w! c1 i" K/ r6 \
那你应该观察一下刚铺好梯度的时候分层是否明显，可以看出你铺的好不好

lxy07

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% T: ^9 I, ?7 U9 y3 T- k- W+ X1、是人的，Ficoll也是分离人的。
, P$ l/ v) Z( y. a/ @  u) B2、我们用的也是TBD的，降速已经调低了。
; Z& [6 u, C0 q5 E5 R1 a3、脐血，75ml，血样算新鲜的，没有凝块。
- E# L+ S( B) s. t8 g7 e2 G8 b4、我看有的帖子上说，取白膜层的时候要蹲着平视离心管操作，这样做是不是能更好的吸到白膜层。

lxy07

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( y; F# H( c3 x8 J. X' Z1 `
! W; V/ ~7 w& S/ f0 n4 y你是说血加上去以后吗？刚铺好不久后，就像cloudycity说的，血自然沉降像细雪一样降下来，但没有看到分层啊。

维维睡啦

1、先检查一下你们的FICOLL是否为MNC专用，其密度是否符合标准,为1.077±0.001。/ K: w( M: O2 x. i3 u. H
2、全血加FICOLL之前要去血浆，稀释的。" h& o1 F2 r# d) \& x9 E- o2 f9 v* j
3、加FICOLL时要小心仔细，使FICOLL和血细胞有明显分层。) k# Z) ^6 R; z% E
4、FICOLL离心时，升降速都要调低，一般为升6降4就可以。5 M8 U/ [* w( b% l, z
5、离心后即使没有明显白膜层，也会有明显的三个分层，上层为生理盐水和血浆混合，中层FICOLL层，下层血细胞。白膜层就在中层FICOLL层中，即使没有明显分层，绝大多数单个核细胞也是在这一层中，如果没有明显分层，可以把这一层液体全部吸出来，再离心获取单个核细胞。
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lxy07

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, j# _" u1 _6 Q" B: u% d) R* L9 _' e% `. g2 B/ h7 A- ~% V2 ^
1、Ficoll是MNC专用，密度是1.077。
8 I7 q8 E7 i3 T) j- p2、去血浆，稀释了。8 p2 U$ T% ~- w. p) ?
3、FICOLL和血细胞有明显分层。
+ Y4 ^# ?( J1 \- k4、升降速调低了。
- _% u& l2 [" u9 G) a- M2 d5、离心后有明显的三层，如果将中间层的液体全部吸出来，会使混的红细胞和血小板等杂细胞较多，有的人主张白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在1公分以上，是否有必要。