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成骨诱导培养: 取第 3代细胞, 接种入含体积分数为
8 n/ |) x9 ?) P, o0.1 的新生牛血清 、2 @5 w* G4 [' z; N h" |
0.1 μmol/L 地 塞 米 松 、' X+ i8 E- q6 {& ] q
50 μmol/L 抗 坏 血酸 、1 a' L& a+ C5 O! D
10 mmol/L β- 甘 油 磷 酸 钠
/ b( ?- r1 A. |" N% o1 b3 ?$ a/ L的 高 糖 DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测:
- F3 R3 e7 e, c' l①碱性磷酸酶组织化学染色: 8 |* l" [4 C3 _5 ], ]* L
取成骨诱导 14 d 的细 胞 , 40 g/L 中 性 甲 醛 固 定 15 min, Gomori改良钙钴法染色。取 5 块玻片, 每片随机取 2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色 阳性细胞的百分比。
# O5 C+ v+ q. ?) y+ }$ v5 r②碱性磷酸酶活性检测:
, M( Y U2 T6 @1 k% q取第 3 代细胞, 以 1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导 3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
! _' U$ f! R( Q7 z& \. |③钙结节染色: 1 a4 |9 D4 ^, ?
Von Kossa’s矿化结节染色法
+ s6 p! s" X- e4 I原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。# M2 Z1 y- f5 a* P
Van kossa银染色法
9 H* Q+ p$ ]% k5 S: J$ @3 U9 A试剂：
, g( ~! ~& R" j4 L% R 1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100 ml。( N6 J, Z' [5 u( Q
2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100 ml。& Q: j* c2 P% y w
' b* K% x w* d. m9 r
培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次- Q" [* t3 \1 O7 k1 ?
2. 2%硝酸银内置暗处1小时0 J( k5 C- z; C n& q _/ W3 `7 C
3. 蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟5 a4 c; t: v* p& A$ A: |' y
4. 还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml）
* X1 S2 @9 ^5 n) d4 o7 ]5. 5%硫代硫酸钠1小时, K5 h' U/ a7 `
; L8 X8 d4 f3 B! y2 o# Z
1.固定后的细胞爬片用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤2遍；
; |# C8 e8 A& Q. c4 s 2.浸入5%（也有1％）硝酸银水溶液中10min，日光或紫外光曝晒10－45 min，蒸馏水洗涤； U4 ]% E; H, ^8 t
3.浸入5%次亚硫酸钠（3%硫代硫酸钠冲洗）溶液中，蒸馏水洗；
9 c! {( o2 i5 p% s$ k8 K6 W 4.1%中性红衬染1 min，水洗，晾干，酒精系列脱水（常规顺序：80％－90％－95％－100％1－100％2），二甲苯透明，中性树胶封片。
7 q$ V! H, z5 i% Z# b" H, z 1. Sections to water. 切片脱蜡至水 0 `: h ?7 k" C0 Q% c: M- e# a. }
2. Place sections in 1% silver nitrate solution under ultra- violet light for 45 minutes. 4 Q: [; K4 J- s( T, L( j D
置于1％硝酸银溶液在紫外光下45分钟! N- t1 L# s3 v1 L. S! w
3. Wash in distilled water. 蒸馏水漂洗& W# o% a! g: X
4. Treat with 3% sodium thiosulphate for 5 minutes. 3％硫代硫酸钠处理5分钟
6 |5 x2 v, A" L/ v5 k( |# w1 q5. Wash in water. 用水漂洗3 T8 {/ S" R0 ]9 J
6. Counterstain with van Gieson for 5 minutes. Van Gieson复染5分钟
- z8 d" u' ]* {* J9 k7. Wash in alcohol. 乙醇漂洗4 S `$ I; M7 l- ?5 J
8. Clear . Mount sections in DPX 透明封片8 T% u2 b) R: s1 j$ l
结果：钙盐沉积区域呈黑色，背景红色.
: g) l+ r7 @- J( I3 e4 S) [. }- f/ O( ^
A 组以现行报道方法染色:4 %多聚甲醛固定标本 ,# ^! G! K2 r9 y/ _3 q# L$ r! e
1 %硝酸银溶液紫外线下染色 10min ,
/ A" P' K& V! l% ~% M# @( u用 5 %硫代硫酸钠染色 2min ,8 |/ h [3 k1 S, I, N& d/ P
1 %中性红复染 10min ,
0 m: V. Q) Z2 {/ I6 i5 A酒精冲洗后观察。
0 D1 A7 V& Z( U
3 l! U n. P1 ]2 p$ }* W0 [' \. KB 组以改进的方法染色:
+ `4 {% U, g6 b' x7 p) j/ Z 4 %多聚甲醛固定标本 ,
/ D+ |% T5 ]- Y8 F1 u5 %硫代硫酸钠孵育 30min ,蒸馏水冲洗 6 C/ T: I% D: _& [4 J x# i
,然后用1 %硝酸银溶液紫外线下染色 30min ,
& w$ [; g- N; i6 b0 S蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质 ,+ P8 ^: t! W+ A2 {. a, t
继续用 5 %硫代硫酸钠染色 2min ,
% _$ p+ X5 {# J0 l1 %中性红复染 10min ,蒸馏水漂洗后观察。; n" P5 y6 l9 w( }7 ~
; ?* Z. b% O* [6 |6 E
或取成骨诱导 21 d 的细胞, 体积分数为 0.95 的乙醇固定 15 min,
" R2 L- E" b( M; b, [! a10 g/L 茜素红 S 染液在室温下浸染 10 min, ) a$ \& [" Z; j7 S
去离子水洗涤3次,
8 U3 Z+ P! T& n- m3 A1 ?8 k* j倒置显微镜下观察。
& z+ K* m/ o. `" p* b* r二、茜素红染色
5 ~9 B7 Z# q7 e' P2 b茜素红S3 l1 p v& h5 Z( ^
中文名称: 茜素红S英文名称:alizarin red S; sodium alizarin sulfonate
* y- Y1 N M# a# E6 Z$ UCAS: 130-22-3分子式: C14H7NaO7•H2O分子量: 360.28中文别名: 9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐； 茜素红；（3） 茜素磺酸钠 ；茜素S ；酸性媒介茜素红；酸性媒介红S-80（Acid Mordnat Reds-80）；C. I.媒介红3（C. I. Mordant Red 3）。
2 L. s1 x5 h2 }; }- B5 s0 p性质：橙黄色的针状体。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。1%水溶液pH2.15。由茜素经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得。茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物，在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；酸碱指示剂，第一变色范围PH值3.7(黄)～5.2(紫)，第二变色范围PH值10.1(紫)～12.0(浅黄)；用于极谱法测定金属离子。
3 e3 v: s1 R) i/ Q) b用途: 络合滴定指示剂和酸碱指示剂。) ]) T/ r3 g# b0 A2 X
配制：将托盘天平上称取0.1g茜素磺酸钠定溶于100ml蒸馏水中转移入滴瓶中，贴标签备用。 或用茜素红粉加PBS溶解后，要注意调节PH值到7.2！过滤就可以了。0.1%的茜素红Tris-HCL(PH8.3), Tris的浓度做分子生物学一样的，用0.1mol／L的HCI或0.1％的NaOH调节。+ F9 g/ s2 @1 u9 O# ]5 R
茜素红染液配方
& X3 \/ D6 [% l+ w4 T- T配方一 茜素红染液（Ⅰ）
0 R1 @4 U+ R. p+ s6 k% Y1 B取冰醋酸5毫升、甘油5毫升、1%水合氯醛60毫升混合。在这种混合液中方入少量茜素红，制成茜素红饱和溶液。
0 g& P- ~3 ?: E# I! c i配方二 茜素红溶液（Ⅱ）
7 Q7 j! O/ n9 \0 _' B取1克茜素红，溶于100毫升95%酒精中，搅拌，然后跟900毫升1%氢氧化钾溶液相混，即成深紫色的茜素红染液
p( K* J3 B' Y?茜素红(Fluka)溶于96％乙醇中配成0.12％的茜素红液。
5 W9 W; q' m5 Q6 e1 W配方三
( \7 X9 d" c) i, m% A! A! S7 v$ _0.1%的茜素红配Tris-HCL(PH8.0)
! {9 ? d5 l K0 [( P! o% v2 i具体配制方法――1g Tris（1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中，用滴管往配制液中加HCl（分析醇），一滴滴地加，边加边测试PH，待PH为8.3左右即可（无精密PH测试仪，用PH试纸也是一样的，但是要能测到8点几的PH试纸），配好后往里面加0.1g的茜素红，便得到0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)溶液。: O- @+ b3 w. Q+ P. U
茜素红染色步骤
* @" k8 q1 Q; V1 K' B1、弃培养基，培养皿用PBS冲洗2次， F3 w% z" I2 q4 B
2、95% (也有90％)乙醇固定10－30min，蒸馏水冲洗3次
3 G/ f- a: M0 S) O0 m/ b+ @, x3、 0.2% （or 0.1%）茜素红[茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)]染色,37℃,30min ,用清水冲洗。7 q& J3 [. J6 j, K h$ Z
在低倍镜视野(4 ×10) 下进行矿化结节计数
0 ^0 ]1 ]1 R/ C" v$ P# ^% M! E' D4 c$ i& n n4 R
钙染色法—茜素红法
* c: q: J- U3 a染色步骤 2 x/ V' {* o1 ^' k4 v3 W, `' u# n
1． 茜素红S染液5分钟 $ ]6 c% @ J6 A: g$ b
2． 用丙酮洗20分钟
' _' C6 Y* M5 [7 W( S3． 丙酮：二甲苯（1：1）溶液20秒
) Y8 Z5 @9 E. G1 r" A' s4 [4. 树胶封固
' e/ M! M# Q) I结果：钙累及物呈桔红色
. G2 x/ i, `/ P5 V1 H' [3 w6 Q/ \$ f' W1 n
④Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色（成骨特有）) u0 b6 L A" z& i: }# G7 w
取成骨诱导 7 d 的细胞爬片,磷酸盐缓冲液漂洗, 4 ℃ 丙酮固定 10 min, 磷酸 盐 缓 冲 液 洗 3 次 , 5 min/ 次 ; 体 积 分 数 为0.03 的过氧化氢孵育 10 min, 磷酸 盐 缓 冲 液洗 3 次, 5 min/ 次; 血清封闭液封闭 15 min, 倾去封闭液, 磷酸盐缓冲液稀释的Ⅰ型胶原Ⅰ抗 4 ℃ 过夜, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次;兔抗羊Ⅱ抗室温 1 h, 磷酸盐缓冲液洗 3 次,5 min/ 次; 辣根酶标记的链霉素卵白素工作液室温 15 min, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次,二氨基联苯胺显色, 自来水冲洗、复染、脱水、透明、封固。 |
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发表于 2009-3-24 11:08
发表于 2010-3-17 18:19
