好文章：实验室中PCR引物设计所要关注的黄金法则 - 实验室综合讨论区干细胞之家



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发表于 2009-3-31 15:50 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研% {! r/ L0 s3 [: Z- `
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不& b& I. l- u  V/ j2 _) [, v# Y
合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚; J% o% [+ |# u" J; E
体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得  ~2 P% _8 V. s4 b- F" ?
到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR/ G, A* {$ e2 _9 `9 k
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件
使用问题进行探讨。- z  U" W; |% m4 ~3 J

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
　　DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。7 J7 J! C: H8 [" J8 a' s/ _
1 R! [) [% c# X1 _6 A. J
　　2.引物长度一般在15~30碱基之间。1 n6 T! I, F$ {5 [* k
* D& \9 M- h/ b
　　引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
* Z# ?$ i" B% y# h- x
　　3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。0 i' b7 q0 D( u5 b$ |0 \
$ x2 B8 X: r( J" h( o5 U/ P
　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
. W( T2 p! r& \
　　4.引物3′端要避开密码子的第3位。$ [( l% L9 x6 b# s' ]2 ?
! K8 P$ x; e+ ^- T* C
　　如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

　　5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
4 \/ _! y; K4 p0 p( n  `
　　引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。! ~, `# [6 _  {; [, q/ R: V
& ]# p' |/ K6 S
　　6.碱基要随机分布。
" U& P; j) P( V! r1 ~
　　引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
5 W& e/ J6 _& O! Q$ B
　　7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

　　引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。* o! _6 m) O$ @- A
5 a/ _# z& ]1 q4 ~8 C) {4 Y: E3 ]
　　两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。' U7 r( a6 J2 N
0 g; @: l  U, w. [" J2 d8 O' G
　　引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

　　8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

　　△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）4 m2 [5 h' h7 b9 x/ S1 P) y

　　9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。3 \  Q: N# L6 U' L5 c) A
1 X% ?) Q/ O1 M
　　引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
) Q/ I5 s; k7 k4 E$ U# S0 q4 S4 Y
　　引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。! E* y" p; d. R/ E' e" k7 T3 F

　　10.扩增产物的单链不能形成二级结构。) Q6 X$ y3 J) m4 O# e& ~& x3 l

　　某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
; {' ~+ v+ {% V$ i( k
　　11.引物应具有特异性。
+ A7 N4 y0 T, u+ @4 v0 H: n
　　引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

　　值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。) m8 f. p* H1 e5 V6 X9 h: d; T

　　做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

　　1)避免重复碱基，尤其是G.$ x: u5 r2 ^1 v, }
2 C3 x; I" G5 \6 j
　　2)Tm=58-60度。

　　3）GC=30-80%.

　　4)3"端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.. q3 t/ y, b' c; A! s* _
# G, H" U8 S! l' F, b" Z8 D
　　5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。- ?  g3 R+ T. A; L

　　6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。

　　7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；6 L4 g% Q7 Q$ e( ~" U5 [

　　要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。& G0 D0 ~- E7 L3 n, s$ H/ h) `
9 ]$ ?# e; p0 i6 f
　　而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

　　至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。' t) V$ l  x& ?( J7 ~

　　做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
: \- i& h" J! ?5 n1 [* ]% ~" g! K
　　关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。