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自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研9 x: ?- m5 ^# X" ], b9 T4 H
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不/ |1 x+ f% P* D( K6 T
合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚
7 f" g8 u( |1 W$ X s体带），不出带或出带很弱，等等。
+ i" L( E+ L& w; O5 I现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得
( Z* M) R( `8 j: ], S到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR* v& T5 f1 u6 y3 Y
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件8 U9 ^* O8 _1 S5 ^4 u# d7 o+ X
使用问题进行探讨。; t$ X& Y* R0 ~" l0 W# X9 J
. Y5 ?$ q: w0 W+ q: I' v* R w* O9 A& ^( N4 i) j# `* b
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 3 o6 Y( S" F$ X
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
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2.引物长度一般在15~30碱基之间。* G U9 z7 a b) W \1 H) S$ T5 O
; v$ D+ z0 s) \2 b( \% ^
引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
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9 Q, d/ _: F$ p3 n3 k 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。) U' i% Q! k5 |4 |
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GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。# f. O1 k0 [# Q5 M3 b
! h2 m. a# g3 w6 D0 s 4.引物3′端要避开密码子的第3位。# O: j/ y8 A+ `
$ n& d% y+ H1 `) _ 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。4 p+ z) d2 |6 {3 c
3 I" v7 j4 k8 U, w y* A. q/ I 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
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8 S; @ ^2 C; r8 H9 J+ E 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。2 ~; u7 I+ f; Q# j3 ~* y* f3 E" n
2 D$ t$ _; U& T- h- Q4 y/ o9 A 6.碱基要随机分布。% O/ H# b* R: D) {
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引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
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$ k0 K% D2 _: e. ^: r 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。9 J/ o- }5 u* @/ [# {* q, @/ T0 w1 b
1 S. z- r" _2 b 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。9 K% C: M$ N9 w* m- w" H
: x) P) }6 f2 v: ^& Y6 I 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。# ^5 W1 D" G7 d0 ~
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引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。6 x/ }9 w1 k0 t5 Z
- T! u0 o& m' A* D" @0 } W) \ 8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
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/ ^: m9 c8 P& L1 j △G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）
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9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
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引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
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7 X" F" q/ c) X, e, X# E0 J5 n 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。0 k ~' N# U* h' ?0 d
7 W6 d5 b5 Z* R, Q 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。6 A. @$ m" v+ K1 R0 M" _. H/ c( K
+ ^6 y0 L; ~- F* g# B 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。3 j9 H1 w" @ x1 r1 m7 Z" F6 |2 Z
: n4 f& \) }; B# y 11.引物应具有特异性。7 D4 O; z2 l/ O1 [2 o2 b% }
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引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。) H& x/ M, J3 g$ e
: O* n0 S4 u0 g! z: f1 w5 i
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
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做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：9 b ^0 {5 p% ~1 r' b
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1)避免重复碱基，尤其是G.# `+ B4 v* d9 Q) M
& z: {( }9 `# W, f$ _9 q 2)Tm=58-60度。2 b5 q3 j2 p1 f( T* W6 O
/ t0 ]( j2 n. a# x c& y8 x 3）GC=30-80%.8 [9 t# w4 Q+ Q- `) @
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4)3"端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C., p+ u- l/ K2 q! E; C% J. N) s6 I; M- T( q' z
' w9 L4 z3 F5 }0 x- {0 w 5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
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6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。# G" \9 j+ E+ D
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7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
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$ T0 D2 _% M- C, N0 |, t$ l 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。* P# D2 n& B- r7 v W
( M- @+ Y. @: x 而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。% v- w6 ?2 ?: H2 b1 `
7 i/ H; K. J, F0 S$ G 至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。) z' G( ~* f O0 X+ D3 R
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做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
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关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。 |
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发表于 2009-3-31 15:50
发表于 2009-6-13 13:07
