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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
+ V4 I# L" d$ L0 J8 f& m+ e Z D大致培养过程：, E- g9 d0 a' o
D0
! f* o1 \9 D% E用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。# b7 s. Z& a: ^& ?2 G0 n* j, T
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。5 \9 E/ M, \8 i
D3- ?) A' K1 [! }# {3 |3 e
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml3 P% H5 E, M( a: `; e7 @
D6-D17
- w! K9 n x5 T: q每隔两天计数并调整密度为200万/ml
8 b: q. K& x3 X8 s! LD17
+ H8 f$ b/ _$ H: ]; i7 Z收集细胞并表型检测。
8 h2 Z9 e5 N9 K% U P此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
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1 N B0 F, @ T( c另外再分享一下开发NK工艺的经验
% b. [( p1 ?. h9 W1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。/ t) G4 U% P; I2 X
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
/ o9 X. r/ M* D3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
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以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
. Y5 r$ @$ E" Z: u+ @$ i" C# y另外对NK培养提几点经验：
. A3 c4 n" g: O- H: ~1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。0 @" \# F* V9 T5 D- \$ Z1 V
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好0 a0 F# U* R7 M8 d0 u$ a+ Z
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
4 `3 ?9 U; v) Q3 e, r- q6 }4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
