个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。9 k9 A9 E  q5 _# f3 v5 X7 Y
大致培养过程：0 M5 N. k3 t6 ~6 _. ~' C& H$ F; q
D01 P5 E) }" |8 N' L) q! y% \5 w
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
, p5 d! L  T- G6 a- b% t培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
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6 E6 Q6 O7 O, k; j9 D对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml7 j6 S5 Y) F. \8 w
D6-D17: H( I+ T3 J; [$ Z2 L2 g4 g7 M
每隔两天计数并调整密度为200万/ml! h% y8 n  @4 _
D17" I, j" ^3 F; A0 r- k8 p
收集细胞并表型检测。- d9 u6 F: z% E1 S/ j1 `4 J6 ?) i
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
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另外再分享一下开发NK工艺的经验1 b/ }/ h' B/ c6 s$ N3 r. i: S
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
% w$ _# d8 K2 m. R$ U9 M2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。/ e/ Q% M4 X3 j/ t/ ~
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
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以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
& a" A0 S( Y( e' n) v$ V另外对NK培养提几点经验：+ ]! o1 k4 y. G. f
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。; g+ v% Y# |+ D
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
% b* b: Z" h/ q8 y3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
5 q- x. d7 F7 M& g& `" P; g4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

回复 chenlin080102 的帖子3 _8 a: L' O+ \0 |# M8 S9 H
: p( I: s0 z* G. E) n0 b. ?
楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

回复 暖羊羊 的帖子2 _5 i. E/ x+ |8 z2 ^
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可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

回复 syj7888 的帖子, {1 a/ J3 \: c2 l" i: B% _7 s6 L

6 g& t6 N: R* L+ R' x尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

回复 lunyuyuanxj 的帖子7 S) I; M3 z  D; D  O
8 \% t8 ]* q2 [3 c! I2 i
这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了